CJI (Traditional Chinese Medicine)
加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎软骨修复疗效及作用机制研究
张永辉1，欧梁1，邝高艳1，卢敏 2
1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；
2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007
摘要：目的 探讨加味独活寄生合剂促进膝骨关节炎（KOA）软骨细胞增殖的临床疗效及其作用机制。方法 采用随机数字表法将 60 例患者随机分为治疗组和对照组各 30 例。治疗组予加味独活寄生合剂，每次
62.5 mL，每日 2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，每次1粒，每日3次，口服。对照组予双醋瑞因胶囊，每次 1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，用法用量同治疗组。嘱患者行股四头肌舒缩功能锻炼，注意保暖。连续治疗6周。观察2组治疗前后视觉模拟评分法（VAS）评分、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎
指数（WOMAC），检测患膝关节液白细胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）、Wnt5a、β-连环蛋白（β-catenin）、
Sox9、胶原蛋白Ⅱ（CollagenⅡ）含量，监测不良反应。结果 与本组治疗前比较，2 组治疗后 IL-1、NO、
Wnt5a、β-catenin 含量明显降低（P＜0.05），Sox9、CollagenⅡ含量明显升高（P＜0.05），VAS 评分、WOMAC
明显降低（P＜0.05），以上指标 2 组治疗后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2 组均未见明显不良反应。结论 加味独活寄生合剂可降低关节液中炎症因子水平，抑制Wnt 信号通路，通过调节通路中 Sox9、CollagenⅡ表达促进KOA软骨细胞的增殖分化，有效缓解疼痛并改善关节功能。关键词：加味独活寄生合剂；膝骨关节炎；软骨修复
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.007
中图分类号：R274.94 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)01-0028-05
Clinic Efficacy and Action Mechanism of Promoting Repairment of Knee Osteoarthritis’s Cartilage Corpuscle via Modified Duhuo Jisheng Mixture
ZHANG Yong-hui1, OU Liang1, KUANG Gao-yan1, LU Min2
1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China;
2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China Abstract: Objective To discuss the clinic efficacy and its mechanism of action in promoting the cell proliferation of knee osteoarthritis’s cartilage corpuscle via modified Duhuo Jisheng Mixture. Methods Totally 60 cases were divided into treatment group and control group by random number table method, with 30 cases in each group. Treatment group was given modified Duhuo Jisheng Mixture, 62.5 mL each time, twice a day, orally, and sulfoglycan sulfate capsules, 1 capsule a day, three times a day, orally; while control group was given diacerein capsules, 1 pill a day, twice a day, orally, and sulfoglycan sulfate capsules, the same as treatment group. Patients were required to do quadriceps muscle systolic and functional exercise, and keep warm. The treatment lasted for 6 weeks. VAS score and WOMAC of the two group were observed before and after treatment. IL-1, NO, Wnt5a, β-catenin,
Sox9, Collagen Ⅱ in knee joint fluid were detected. Adverse reactions were monitored. Results Compared with pre-treatment, the contents of IL-1, NO, Wnt5a and β-catenin in two groups were reduces (P<0.05); while the contents of Sox9 and Collagen Ⅱ were raised (P<0.05). The VAS scores and WOMAC were reduced in two groups after treatment (P<0.05). There was no statistical significance between the two group in the above indexes (P>0.05). There were no obvious adverse reactions in both groups. Conclusion Modified Duhuo Jisheng Mixture can reduce
inflammatory factors of the joint fluid and inhibit the Wnt signal pathway through regulating the expression of Sox9 and Collagen Ⅱ in the pathway, which can promote the cell proliferation of knee osteoarthritis's cartilage corpuscle and benefit the repairment of cartilage corpuscle in order to relieve pains and improve functions of knee joint.
Keywords: modified Duhuo Jisheng Mixture; knee osteoarthritis; repairment of cartilage corpuscle
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年常见疾患，随着病情逐渐加重，严重影响患者的生活质量。近年来，中医药治疗 KOA 取得了良好疗
效[1-3]，但发病机制尚不明确，缺乏特异性疗法。目前基础研究主要针对中医药对 KOA 中软骨的细胞因子某一基因层面的干预作用，多局限于补肾活血类或补肾类药物对 KOA 的干预作用，尚未系统阐明补肾活血、祛痹止痛中药治疗 KOA 的作用靶点基因和调控通路。本研究采用自拟加味独活寄生合剂，治疗肝肾亏虚、风寒湿痹型 KOA，观察其疗效及对关节液内 Wnt信号通路相关蛋白含量的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2016 年10 月－2017年3月湖南中医药大学第一附属医院骨伤科门诊患者 60 例，采用随机数字表法分为治疗组和对照组各30例。治疗组男性8 例，女性 22 例，平均年龄（59.2±3.5）岁，平均病程
（3.6±1.8）年；对照组男性 11 例，女性 19 例；平
均年龄（58.1±3.4）岁，平均病程（3.7±1.6）年。
本研究无脱落、退出病例。2 组患者年龄、性别、病程、视觉模拟评分法（VAS）评分及西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）比较，差
异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查批准。
1.2 西医诊断标准
参照《骨关节炎诊治指南（2007 年版）》[4]制定诊断标准。①近1个月内反复膝关节疼痛；②X线片示关节间隙变窄，软骨下骨硬化和/或囊变，关节缘骨赘形成；③关节液透明、黏性，检查示白细胞＜
2000 个/mL；④年龄≥40 岁；⑤晨僵时间≤30 min； ⑥活动时感觉有骨摩擦音。具备上述①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明确诊断。
X 线分级采用骨关节炎 Kellgren-Lawrance 分级
标准[5]。0 级：正常；Ⅰ级：轻微骨赘；Ⅱ级：明显骨赘，关节间隙可疑变窄；Ⅲ级：关节间隙中度变窄，软骨下骨硬化；Ⅳ级：大量骨赘，关节间隙明显变窄，严重软骨下骨硬化及明显畸形。
1.3中医辨证标准
参照《中医病证诊断疗效标准》[6]风寒湿痹、肝肾亏虚证进行辨证。主症：关节酸痛或部分肌肉酸重麻木，迁延日久可致肢体拘急，甚则关节肿大。次症及舌脉：肢体关节走窜疼痛，痛无定处，有时兼有寒热，舌苔黄腻、脉浮；遍身或局部关节疼痛，痛有定处，得热稍缓，遇冷则剧，苔白，脉弦紧；关节酸痛、肌肤麻木、痛有定处，阴雨风冷可使其发作，苔白腻，脉濡缓。脉沉细或沉弱无力。具备主症，参照次症及舌脉即可辨证。
1.4 纳入标准
①性别不限，年龄 50～65 岁；②符合上述西医诊断标准及中医辨证标准者；③X线分级为 0～Ⅱ级者；④无严重心、肺及肝、肾功能障碍者；⑤近2个月内未服用相关药物或采用相应治疗方案者；⑥患者自愿参加本研究并签署知情同意书，依从性良好者。
1.5 排除标准
①对本研究药物过敏者；②X 线分级为Ⅲ、Ⅳ级者；③慢性结肠炎、腹泻、服用改善肠道转运和/或肠道内容物性质的药物、服用含有氢氧化铝和/或氢氧化镁的药物者；④创伤性膝关节炎者；⑤有严重的心、肺及肝、肾功能障碍者；⑥近期拟怀孕、妊娠期及哺乳期患者。
1.6 治疗方法治疗组予加味独活寄生合剂。药物组成：独活
6 g，桑寄生 18 g，制天南星6 g，黄芩6 g，木瓜 12 g，威灵仙12 g，杜仲 12 g，牛膝 6 g，细辛 3 g，秦艽 6 g，茯苓 12 g，肉桂 3 g，防风 6 g，川芎 6 g，党参 12 g，甘草3g，当归 12 g，白芍 10 g，熟地黄 15 g。湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，批号201601。每次 62.5 mL，每日 2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊（浙江海正药业股份有限公司，批号 7108197，
0.314 g/粒），每次 1粒，每日3次，口服。对照组予双醋瑞因胶囊（TRB Pharma S.A.，昆明积大制药股份有限公司，批号 69577，50 mg/粒），每次 1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖胶囊，用法用量同上。
嘱患者行股四头肌舒缩功能锻炼，注意保暖，勿进行加重膝关节负重的活动。均连续治疗6 周。
1.7 观察指标
1.7.1 视觉模拟评分法评分于治疗前后对2组患者行 VAS 评分[7]。在设定好的评分表上划一条10 cm的线，横线的一端为0，表示无痛，另一端为10，表示剧痛，患者根据疼痛感觉进行评分。
1.7.2 西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数
参考文献[8]于治疗前后评价 WOMAC，包括疼痛、僵硬和关节功能 3 个部分，共 24 个项目（包括疼痛 5个、僵硬2个、关节功能17 个）。WOMAC 越
高，表示关节炎越严重。＜80分为轻度，80～120 分
为中度，＞120分为重度。
1.7.3 患膝关节液相关指标
2 组于治疗前后行关节腔穿刺抽取关节液。患者仰卧位，膝下垫枕，取髌骨外上方入路，定位准确后碘伏消毒，抽取关节液 1 mL，置于无菌管。ELISA检测 IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin、Sox9、CollagenⅡ含量，严格按照试剂盒（DG biotech 公司，批号分别为
E-EL-H0149c、A013-2、E-EL-H1038c、E-EL-H0666c、
E-EL-H1349c、E-EL-H0787c）说明进行操作。
1.7.4 不良反应
观察2组治疗期间有无腹泻、腹胀等不良反应并记录。
1.8 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示，组间比较采用 t 检验及非参数检验；计数
—
资料组间比较采用卡方检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果2.1 视觉模拟评分法评分及西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数比较
与本组治疗前比较，2 组治疗后 VAS 评分、WOMAC 均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
2 组治疗后 VAS 评分、WOMAC 比较，差异无统计
学意义（P＞0.05）。见表 1。
2.2 2组患膝关节液白细胞介素-1、一氧化氮含量比较
与本组治疗前比较，2 组患膝关节液 IL-1、NO
含量明显降低（P＜0.05），2 组治疗后比较差异无统
计学意义（P＞0.05）。见表 2。
2.3 2组患膝关节液 Wnt5a、β-连环蛋白、Sox9、胶原蛋白Ⅱ含量比较
与本组治疗前比较， 2 组治疗后患膝关节液
Wnt5a、β-catenin 含量明显降低（P＜0.05）；2 组治疗
后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。与本
组治疗前比较，2 组治疗后 Sox9、CollagenⅡ含量明
显升高（P＜0.05）；2 组治疗后比较差异无统计学意
义（P＞0.05）。见表 4。 2.4不良反应
对照组轻度腹泻2例；治疗组轻度腹胀、消化不良 1 例。2组均无明显不良反应。
3 讨论
KOA 属于中医“痹证”范畴，称之为“膝痹”。《素问•痹论篇》认为“风寒湿三气杂至，合而为痹”， “骨痹不已，复感于邪，内舍于肾”。《张氏医通》认为：“膝者筋之府，膝痛无不因肝肾亏虚者，虚则风寒湿气袭之。”中医对该病的病机认识以肾虚邪实为主，治以补虚泻实。
本研究选用独活寄生汤加黄芩、木瓜、威灵仙、制南星，制成加味独活寄生合剂。本方重用善治久痹伏风的独活，加大桑寄生、杜仲、牛膝用量以补益肝肾；木瓜、威灵仙祛风散寒除湿，二药配伍刚柔相济，入腑通络，善治湿邪久病入络、病变位置较深者；制
南星善入经络，辛温散寒燥湿止痛，黄芩取反佐之意，苦寒清热，制约全方温燥之性。诸药合用，共奏补益肝肾、祛风除湿、散寒止痛之功。
IL-1、NO 是关节液中炎症因子，二者可引起关节液和滑膜的免疫炎症反应，NO 是促细胞凋亡的重
要因子，IL-1β 可依赖内源性 NO 诱导细胞凋亡，进一步促进关节软骨的凋亡破坏，在 KOA 发病中具有重要作用。药理研究表明，黄芪苷能够明显降低血清中 IL-1 含量，木瓜三萜可抑制 RAW264.7 细胞分泌
IL-1等促炎因子而发挥抗炎作用，威灵仙水提取液可降低兔KOA 局部 IL-1β、TNF-α，大剂量制天南星可降低兔KOA关节液中 IL-1 含量，减轻滑膜炎症[9-12]。
邝高艳等[13]认为，加味独活寄生合剂可减少关节液中
IL-1、IL-6、TNF-α 及 NO 含量，抑制炎症反应，改善临床症状，这可能是加味独活寄生合剂治疗 KOA的作用机制。
双醋瑞因胶囊是目前临床治疗 KOA 的阳性药物，研究表明，应用 4～6 周即能对膝关节的疼痛和临床功能的改善取得良好效果，可降低IL-1 含量，同
时诱导关节软骨的增殖分化。本研究表明，2 组患者
IL-1、NO 及 VAS 评分、WOMAC在治疗后均明显降低，表明加味独活寄生合剂可降低患膝关节液中炎症因子含量，对 KOA 有良好的疗效。2 组比较差异无统计学意义，也在一定程度上表明加味独活寄生合剂与双醋瑞因胶囊疗效相当。
KOA 主要是由于关节软骨退变磨损产生炎症介质刺激所致，是力学和生物学因素共同作用的结果。KOA 的严重程度与软骨细胞凋亡密切相关。现代研究表明，Wnt信号通路在骨骼发育、软骨及骨生物学中起着关键作用，通过Wnt信号通路调节能够促进软骨细胞的增殖、分化，从而改善 KOA 的临床症状。
彭旭等[14]研究表明，Wnt3a/β-catenin 信号阻断后，
CollagenⅡ、aggrecan、Sox9 表达明显恢复，细胞增殖能力和向软骨诱导分化的能力有所恢复。Gurusinghe S 等[15]提取 8～12个月健康雄性犬的软骨
细胞进行随机对照研究发现，Sox9组能恢复软骨细胞表型的扩张，此外，软骨细胞经 Sox9 和 CollagenⅡ
作用后，其特异性表达明显增强。卓群豪等[16]研究也
表明，Sox9转染小鼠骨髓间充质干细胞对小鼠膝关节炎病变软骨修复有促进作用。以上研究表明，Wnt信号通路在调节软骨细胞增殖方面具有一定作用，而 Sox9和CollagenⅡ在软骨细胞的增殖分化中具有重要作用。
近年来，中医药在治疗 KOA 方面取得了较好的疗效，但其是否通过 Wnt 信号通路调节尚不明确。2 组在评价临床效果的同时，重点检测了Wnt 信号通路相关调节蛋白，尤其是Sox9 基因蛋白和 CollagenⅡ，以观察加味独活寄生合剂是否能够通过调节该信号通路来促进软骨细胞增殖修复。Wnt 信号通路中
Wnt5a、β-catenin 蛋白较治疗前明显降低，Sox9 和CollagenⅡ较治疗前明显增高，差异有统计学意义
（P＜0.05）。这说明应用加味独活寄生合剂后 Wnt信号通路被抑制，尤其是其关键蛋白 β-catenin 含量降低。有研究指出，β⁃catenin 能与 Sox9 的C端转录激活域结合，从而抑制 Sox9 启动目的基因的转录[17]，而 β-catenin 含量降低，相应能够促使Sox9 蛋白分泌增多，利于 CollagenⅡ蛋白产生，诱导软骨细胞的增殖和向软骨组织分化，从而修复KOA磨损的软骨组织。
总之，本研究中加味独活寄生合剂能降低关节液中的炎症因子含量，且通过调节 Wnt 信号通路促进KOA 软骨细胞增殖，起到保护关节软骨的作用。但本研究样本量较小，观察时间有限，仍有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2017-05-18）
（修回日期：2017-06-05；编辑：季巍巍）