CJI (Traditional Chinese Medicine)
双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎模型大鼠血浆炎性因子和滑膜组织相关因子的影响
严国鸿1，张玉琴2，林雄1，黄燕1，翁淑琴1，徐伟 2
1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 300122；
2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108
摘要：目的 观察双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎（CIA）模型大鼠血浆炎性细胞因子和滑膜组织Toll 样受体 4（TLR4）、髓样分化因子 88（MyD88）、核因子-κB（NF-κB）表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 大鼠尾部皮下注射胶原乳剂制作 CIA 模型。大鼠随机分为正常组、模型组和双藤痹痛凝胶高、低剂量组，ELISA 检测血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β 及 IL-6 的含量，RT-PCR 检测滑膜组织
TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 表达，Western blot 检测滑膜组织 TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表达。结果 与模型组比较，双藤痹痛凝胶高、低剂量组大鼠血浆 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量显著降低，滑膜组织
TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低。结论 双藤痹痛凝胶膏剂可能是通过抑制炎症反应、调节滑膜组织 TLR4/NF-κB 信号通路相关靶点表达发挥抗炎作用。关键词：双藤痹痛凝胶膏剂；胶原诱导性关节炎；Toll样受体4；髓样分化因子88；核因子-κB；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)01-0043-05
Effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on Inflammatory Cytokines in Plasma and Relevant Factors of Rats with Collagen-induced Arthritis
YAN Guo-hong1, ZHANG Yu-qin2, LIN Xiong1, HUANG Yan1, WENG Shu-qin1, XU Wei2
1. People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 300122, China;
2. School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China Abstract: Objective To study the effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on TLR4, MyD88 and NF-κB and inflammatory cytokines in rats with collagen-induced arthritis; To discuss relevant mechanism of action. Methods A CIA model was made by subcutaneous injection of collagen emulsion from rat tail. Rats were randomly divided into normal group, model group, Shuangteng Bitong Cataplasm high-dose and low-dose groups. The contents of TNF-α,
IL-1β and IL-6 in plasma were evaluated by ELISA, and the expression levels of TLR4, MyD88 and NF-κB in synovial tissues were evaluated by RT-PCR and Western blot. Results Compared with the model group, the contents of TNF-α, IL-1β and IL-6 in serum decreased remarkably in the Shuangteng Bitong Cataplasm low-dose and high-dose group, and the expression levels of TLR4, MyD88 and NF-κB in synovial tissues decreased remarkably. Conclusion Shuangteng Bitong Cataplasm can inhibit inflammatory reaction and regulate the expressions of relevant factors in synovial tissues to realize the anti-flammatory effects.
Keywords: Shuangteng Bitong Cataplasm; collagen-induced arthritis; TLR4; MyD88; NF-κB; rats
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以各关节病变为主，同时伴多系统受累的慢性炎症性的全身性自身免疫性疾病。其病理改变主要发生在关
基金项目：国家自然科学基金（81370096）；福建省科技厅引
导性项目（2015Y0060）
通讯作者：徐伟，E-mail：xwfjlab@163.com 节，主要表现为关节腔积液、滑膜炎、炎症细胞浸润、微血管新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏。目前RA的病因尚未完全阐明，一般认为是多因素诱发机体自身免疫反应而致病。Toll 样受体（TLRs）在免疫系统中发挥着重要的作用，能识别外源性病原相关分子模式及内源性分子产生的组织损伤、炎症反应，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细
胞内，产生复杂的级联信号反应，导致核因子-κB
（NF-κB）等转录因子活化，介导白细胞介素（IL）-1、
IL-6 及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性介质基因的表达，引起相应炎症介质的合成和释放，进而趋化和激活嗜中性白细胞，活化淋巴细胞，启动先天和获得
性免疫。TNF-α、IL-1 及 IL-6 等是RA炎症过程中主要的破坏性细胞因子，抑制 TNF-α、IL-1 及 IL-6 活性对控制RA病情进展有重要作用。双藤痹痛凝胶膏剂是在福建中医药大学附属人民医院院内制剂双藤痹痛酊的基础上研制而成的新型制剂，前期动物实验显示，其具有抑制胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠的足趾肿胀、改善关节组织病理学变化、降低CIA 大鼠关节炎指数的作用[1]。本实验在前期研究的基础上，从RA关节炎症的重要信
号传导通路（TLR4/NF-κB 信号通路）途径入手，观察双藤痹痛凝胶膏剂对 CIA 大鼠血浆炎性因子及滑膜组织相关因子的影响，探讨其相关作用机制。1 实验材料
1.1 动物
雄性 Wistar 大鼠 40 只，SPF 级，鼠龄 10～12 周
龄，体质量（220±20）g，上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号 SCXK（沪）2007-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室，光暗周期 12 h/12 h，温度（25.0±0.5）℃，相对湿度 50%～
70%，大鼠适应性喂养1周后开始实验。
1.2 药物双藤痹痛凝胶膏剂（由雷公藤、青风藤、穿山龙、甘草等组成，每贴 8 cm× 12 cm，含雷公藤甲素
246.59 μg，含青藤碱 155.89 mg），福建中医药大学药学院，批号 20140310；空白凝胶膏剂（NP700、卡波姆等水溶性高分子材料），福建中医药大学药学院，批号 20140310-1。
1.3 主要试剂与仪器完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）、牛Ⅱ型胶原，美国 Chondrex 公司；TLR4、髓样分化因子 88（MyD88）和 NF-κB 一抗，Cell Signaling Technology；Trizol 试剂（Invitrogen），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒（Fermentas），DreamTaqTM Green PCR Master Mix
（2X）试剂盒（Fermentas）。CS-1EAS 型电子天平（北
京市菲姆斯科技开发公司），TD5A-WS台式低速离心
机（湘仪离心机仪器有限公司），C1000TM Thermal cycler PCR 仪（美国 Bio-RAD 公司），ChemiDocTM XRS＋核酸成像系统（美国 Bio-RAD 公司）。
2 实验方法
2.1造模
参考文献[2-3]方法建立 CIA模型。将牛Ⅱ型胶原
（2 mg/mL）与 CFA等体积混合，研磨制成胶原乳剂。于大鼠尾部2 cm处皮下注射胶原乳剂0.2 mL/只，并于第 7日在大鼠尾部3 cm处皮下注射牛Ⅱ型胶原与IFA等体积的混合乳液0.1 mL/只，进行 2次免疫。将
关节炎指数评分＞1的大鼠纳入实验。
2.2 关节炎指数测定大鼠初次免疫后第4日开始（每隔3 d）观察大鼠四肢关节病变程度。病变程度按 0～4 级评分法[1]评分，四肢关节炎指数之和代表每只大鼠关节炎指数，积分越高，关节症状越严重，最高分值为16 分。
评分标准：0 分，关节正常无红肿；1 分，趾关节红
肿；2 分，趾关节和足趾肿胀；3 分，踝关节以下的
足爪肿胀；4 分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀、关节严重变形。
2.3 分组及给药除正常组外，动物初次注射胶原乳剂后第2日开始，将双藤痹痛凝胶膏剂贴于大鼠背部固定，每日 1次（同一部位），连续 28 d。其中模型组为空白凝胶膏剂，大小2 cm×3 cm；双藤痹痛高、低剂量组分别给予 3 cm×3 cm、1 cm×3 cm的双藤痹痛凝胶膏剂。
2.4 血浆与滑膜组织的采集与处理大鼠于最后一次给药后，腹腔注射10%水合氯醛
（1 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，收集大鼠新鲜血液约6 mL，室温静置1 h，3000 r/min 离心 15 min，将上清液移至 Eppendorf 管分装，-20 ℃保存备用。
处死大鼠后取右膝关节，沿膝关节正中纵行切开皮肤，直至暴露以膝关节为中心约0.3 cm×0.3 cm 的区域，以有齿镊提起髌骨。沿髌骨上缘向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下缘向上有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，用刀片完全剥离滑膜组织，并完整取下，投入液氮中保存，供指标检测。
2.5 ELISA 检测血浆肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β
和白细胞介素-6含量取适量血浆样本溶解后，根据 TNF-α、IL-1β 及
IL-6 试剂盒说明书的实验步骤加入样品、酶标偶合液、显色剂室温孵育，反应完全后加入终止液，于酶标仪波长 450 nm处测定每孔的吸光度。
2.6 RT-PCR 检测滑膜组织 Toll 样受体4、髓样分化因子 88 和核因子-κB 的 mRNA 表达
采用 Trizol 两步法提取每只大鼠滑膜组织总
RNA，每组 10 只。取总RNA 1 μg 反转录成cDNA。反应体系 20 μL，扩增条件为：95 ℃预变性4 min，
94 ℃变性 30 s，退火 40 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循
环，72 ℃延伸 10 min。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析系统进行观察及光密度扫描，以 GAPDH基因为内参，各基因扩增条带的光密度值与各自内参的光密度值之比作为评价指标。引物序列见表1。
2.7 Western blot 检测滑膜组织 Toll 样受体 4、髓样分化因子 88 和核因子-κB的蛋白表达
滑膜组织加入 RIPA 裂解液后匀浆，10 000 r/min离心 10 min，收集上清液，BCA法检测其蛋白浓度，
20 μL上样，经 SDS-PAGE 电泳分离，电转至固相支持体 PVDF膜上，分别加入一抗和二抗，发光试剂发光，成像。应用 Bio-Rad 软件对 Western 杂交蛋白区带进行积分光密度值分析。
4.4 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠滑膜组织 Toll 样受体4、髓样分化因子 88 和核因子-κB mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织 TLR4、
MyD88、NF-κB mRNA 表达均显著升高（P＜0.01）； 3 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异—
有统计学意义。
4 结果
4.1 一般变化
初次免疫1周后大鼠关节无红肿，活动无明显异常状态出现。随着时间的延长，造模组大鼠活动和进食量减少，毛发干枯，精神萎靡；后足趾关节开始出现红肿，逐步蔓延到尾部，少数可累及前肢，并且日趋严重，关节功能活动障碍，不能正常行走；双藤痹痛高、低剂量组大鼠上述症状明显缓解，且背部连续给药 28 d未发现过敏反应及皮损现象。
4.2 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠关节炎指数的影响初次免疫后模型组大鼠各时点关节炎指数明显升高；与模型组比较，第 12 日后双藤痹痛低剂量组
大鼠关节炎指数明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表2。
4.3 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠血浆肿瘤坏死因
子-α、白细胞介素-1β 和白细胞介素-6含量的影响与正常组比较，模型组大鼠血浆 TNF-α、IL-1β和 IL-6 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠血浆 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 含量
明显降低（P＜0.01），双藤痹痛低剂量组大鼠血浆
IL-1β 和 IL-6 含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），结果见表3。
— 与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠滑膜组织
TLR4、MyD88、NF-кB mRNA 表达显著降低（P＜
0.01），双藤痹痛低剂量组大鼠滑膜组织TLR4、NF-кB mRNA 表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），结果见图 1。
4.5 双藤痹痛凝胶膏剂对模型大鼠滑膜组织Toll 样受体4、髓样分化因子88 和核因子-κB蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织 TLR4、
MyD88、NF-κB 蛋白高度表达（P＜0.01），阳性表达条带清晰；与模型组比较，双藤痹痛高剂量组大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表达显著降低（ P ＜ 0.01 ），双藤痹痛低剂量组大鼠滑膜组织
MyD88、NF-κB 蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜
0.01）。结果见图 2。 5 讨论
TLRs 在免疫系统中发挥着重要的作用，能识别外源性病原相关分子模式及内源性分子产生的组织损伤、炎症反应，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，导致NF-κB 等转录因子活化，介导 IL-1、IL-6 及 TNF-α等炎性介质基因的表达，引起相应炎症介质的合成和释放，进而趋化和激活中性粒细胞，活化淋巴细胞，启动先天和获得性免疫；内源性 TLR 配体被称为损伤相关分子模式，包括活化细胞和坏死细胞释放的内源性分子及细胞外基质分子。多项研究表明，TLRs信号通路与RA 的发病机理关系密切[4-5]。
NF-κB是一种常见的转录因子，炎症反应的核心调控因子。NF-κB由2类亚基形成同源或异源二聚体，最常见的亚基组成形式为 p65/p50 或 p65/p65。正常情况下，细胞内外通路正、负反馈对NF-κB 的活化精细调节使 NF-κB 的活化在适当水平[6]。NF-κB 未被激活
时分布在细胞浆中，可以被炎症因子（IL-1β、TNF-α等）、生长因子或趋化因子等激活，通过 1 个或多个信号途径使抑制性蛋白 I-κB 磷酸化、泛素化并进一步降解，使 NF-κB 与 I-κB 解离，移位至胞核，与DNA上启动子区域相应的靶基因位点结合，进而启动一系列免疫相关基因如前炎症介质（如 IL-1β、TNF-α、IL-6等）及一些炎性相关酶类的转录程序，导致其表达增多，使大量炎性细胞浸润于炎症部位，从而引起或进
一步加重体内炎症反应[7-8]。
有研究表明，NF-κB能促进滑膜细胞的增殖并抑制其凋亡，导致滑膜增生肥厚，加重关节组织结构的
破坏[9]。RA 患者滑膜组织 NF-κB p65 表达及活化水
平均显著高于正常对照组，IL-1β mRNA表达水平也高于正常组，并与 NF-κB 的活化水平呈正相关[10]。另有研究显示，牛Ⅱ型胶原所致的CIA模型大鼠关节滑膜的 NF-κB p65 蛋白表达明显高于正常对照组[11]。本研究结果表明，双藤痹痛凝胶膏剂在一定剂量下可降低 CIA 大鼠血浆 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 水平，降低CIA 大鼠滑膜组织 TLR4、MyD88、NF-κB 的表达，提示双藤痹痛凝胶膏剂可能通过抑制炎症反应、调节滑膜组织TLR4/NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达发挥抗炎作用。
已有研究表明，雷公藤内酯醇[12]、青藤碱[13]、
穿山龙总皂苷[14]等均可抑制大鼠滑膜细胞增殖。双藤痹痛凝胶膏剂是由多味中药组成，含有成分较多，其作用机制可能与这些成分有关，有待今后进一步研究。
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（收稿日期：2017-06-19）
（修回日期：2017-07-24；编辑：华强）