CJI (Traditional Chinese Medicine)
响应面法优选银槐解毒颗粒提取工艺
张江1，张丽2，木卡代斯•斯依提1，赵翡翠 3
1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830000；
2.新疆维吾尔自治区食品药品审评查验中心，新疆 乌鲁木齐 830000；
3.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000
摘要：目的 优选银槐解毒颗粒提取工艺。方法 在单因素试验基础上，采用响应面法考察提取时间、料液比、浸泡时间对银槐解毒颗粒中绿原酸、总黄酮提取方法的影响。采用 HPLC 同时测定绿原酸、总黄酮的
含量，流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；30～
55 min，18%～20%A；55～65 min，20%～23%A），绿原酸和黄酮类成分的检测波长分别为 327、256 nm。结果 最佳提取工艺条件为浸泡时间60 min，加 12倍量水，提取130 min，提取 2次。绿原酸、芦丁、黄芩苷平均浓度分别为 51.497、68.872、25.763 g/g，平均浸膏得率为 33.105%。结论优化后的提取工艺稳定可行，可为银槐解毒颗粒后续生产提供数据支持。关键词：银槐解毒颗粒；绿原酸；芦丁；黄芩苷；响应面分析法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.014
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)01-0064-05
Optimization of Extraction Process of Yinhuai Jiedu Granula by Response Surface Methodology
ZHANG Jiang1, ZHANG Li2, Mukadaisi SIYITI1, ZHAO Fei-cui3
1. College of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China;
2. Examination and Verification Center for Food and Drug in Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, China;
3. Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China Abstract: Objective To optimize extraction process of Yinhuai Jiedu Granula. Methods On the basis of single factor experiments, effects of soaking time, solvent dosage and extracting time on contents of chlorogenic acid and total flavonoids were investigated by response surface methodology. HPLC was used to determine contents of chlorogenie acid and total flavonoids with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid for gradient elution
(0–20 min, 13%A; 20–30 min, 13%–18%A; 30–55 min, 18%–20%A; 55–65 min, 20%–23%A) and detection wavelengthes of 327 nm and 256 nm for chlorogenic acid and total flavonoids respectively. Results Optimal extraction process was as following: soaked 60 minutes and extracted twice with 12 times the amount of water per time of 130 minutes. Concentrations of chlorogenic acid, rutin and baicalin were 51.497, 68.872, 25.763 g/g respectively. The average extract yield was 33.105%. Conclusion The optimized extraction process is feasible and stable, which can provide data support for the further research on Yinhuaijiedu granula.
Keywords: Yinhuai Jiedu Granula; chlorogenic acid; rutin; baicalin; response surface
银花散为新疆医科大学附属中医医院院内制剂，为该院刘红霞教授多年临床实践的经验方，由金银花、槐花、黄芩等 15 味药组成，具有清热解毒、消痈散结之功效，临床用于治疗肺胃湿热所致的寻常型痤疮、酒渣鼻、酒渣样皮炎、脂溢性皮炎。方中金银花、槐花、黄芩为君药。研究表明，金银花水提液体
内或体外均具有明显的抑菌、抗菌作用[1-3]；槐花中的芦丁、槲皮素等黄酮类化合物是其主要药理活性成
分[4-6]，有抗病毒、抗真菌、止血、降压、扩冠等作
用[7]；黄芩苷是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成
分[8-9]，具有极为广泛的药理活性，包括抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、保肝、保护心血管及神
经系统等多种作用[10]。由于银花散口感较差，且该处方药味较多，故拟将银花散改剂型为颗粒剂。银槐解毒颗粒是在银花散基础上开发研制而成。结合中试生
产成本，选择水为提取溶媒，以绿原酸、芦丁、黄芩苷质量浓度的综合评分为评价指标，通过响应面法对提取工艺条件进行优化，为中试生产提供数据支持。1 仪器与试药
1525 型高效液相色谱仪（包括2489 型 PAD 检测器、Empower Pro工作站，美国Waters 公司），Centra-20型紫外-可见分光光度计（GBC科学仪器有限公司），
AG-135型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），KDM型调温电热套（山东鄄城光明仪器有限公
司），DZKW-S-4 型电热恒温水浴锅（北京永光明医
疗仪器有限公司），GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H 型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。
绿原酸对照品（批号 110753-201415，供定量测定用，质量分数以 96.2%计）、芦丁对照品（批号
100080-201409，供定量测定用，质量分数以 91.9%计）、黄芩苷对照品（批号 110715-201016，供定量测定用，质量分数以 94.0%计），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
金银花、槐花、黄芩等饮片购自新疆玖元堂中药饮片有限责任公司，经新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任中药师鉴定，均符合 2015 年版《中华人民共和国药典》相关项下要求。
2 方法与结果
2.1 提取方法取金银花、槐花、黄芩等饮片，加入10 倍量水，浸泡1h，提取 2次，每次2 h。检测提取液中绿原酸、芦丁、黄芩苷的含量，以及浸膏得率，计算综合评分。
2.2 绿原酸、芦丁、黄芩苷定量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件
XTerra C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相 B，梯
度洗脱（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；
30 ～ 55 min ， 18% ～ 20%A ； 55 ～ 65 min ， 20% ～
23%A）；流量 1.0 mL/min；进样量 10 L；柱温 30 ℃；绿原酸检测波长为 327 nm，黄酮类成分检测波长为
256 nm。色谱图见图1。
2.2.2 混合对照品溶液的制备精密称取绿原酸、芦丁、黄芩苷对照品适量，置于 10 mL棕色量瓶中，加甲醇配成浓度分别为0.50、
0.54、0.30 mg/mL的对照品溶液。加甲醇分别制成一定浓度的混合溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备按照各试验参数设计对药材进行提取，放冷，将提取液经纱布过滤，取滤液20 mL蒸干，加甲醇5 mL 溶解，经 0.22 m微孔滤膜过滤，即得。 F t/min
注：A.对照品（327 nm）；B.对照品（254 nm）；C.供试品（327 nm）；
D.供试品（254 nm）E.阴性对照（327 nm）；F.阴性对照（254 nm）；
1.绿原酸；2.芦丁；3.黄芩苷
图 1 银槐解毒颗粒中绿原酸、芦丁、黄芩苷HPLC 图
2.2.4阴性对照溶液的制备按处方量称取除去金银花或黄芩的样品，按
“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 标准曲线的建立
取混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，分别进样 1、4、8、10、12、14 µL，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸
Y＝13 601 155.63X＋435 940.02（r＝0.999 0），线性范围 0.50～7.00 µg；芦丁 Y＝18 925 224.34X－273 481.69
（r＝0.999 7），线性范围 2.16～7.56 µg；黄芩苷 Y＝
20 884 554.03X－21 504.29（r＝0.999 4），线性范围
0.30～4.20 µg。
2.2.6 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的 RSD 分别为 1.74%、1.84%、2.58%，表明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、
12、24 h 进样 10 µL，记录色谱峰面积，计算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的RSD 分别为 1.67%、2.48%、
1.71%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2.2.8 重复性试验按处方量精密称取饮片6 份，按“2.2.3”项下方
法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的 RSD 分别为 0.18%、1.81%、1.62%，表明该方法重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验取已知浓度的待测溶液6份，分别精密加入绿原、芦丁、黄芩苷 2.85、3.60、1.55 mg，按“2.2.3”
下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件定，其平均回收率分别为 101.13%、102.74%、
101.99%，RSD 分别为 1.86%、1.67%、1.89%。结果表明，本方法有良好的回收率。
2.3 浸膏得率测定精密量取供试品溶液50 mL，置于已恒定质量
蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，转移至烘箱内，105干燥至恒定质量，取出，置干燥器中冷却至室温，速精密称定质量，计算浸膏得率。
2.4 单因素试验
2.4.1 提取次数初步考察将加水倍数固定为10倍，浸泡时间固定为1 h， 提取时间固定为2 h，分别按 1、2、3 次进行提取，结果综合评分在1～3次呈增加趋势，但提取2 次与 3次相差不大，见图2。结合实际生产情况，选取2 次作为响应面试验设计的提取次数。
图 2提取次数单因素试验结果
2.4.2提取时间初步考察将提取次数固定为2次，加水倍数固定为10 倍，分别按 1、1.5、2、2.5 h进行提取，结果综合评分在
1～2h呈增加趋势，在2～3h呈递减趋势，见图3。故 2h为最佳提取时间。
图 3提取时间单因素试验结果
2.4.3浸泡时间初步考察将提取次数固定为2次，加水倍数固定为10 倍，提取时间固定为2h，按浸泡时间 0.5、1、1.5、2、2.5 h进行提取，结果综合评分在0.5～1h 呈增加趋势，在
1～2.5 h呈递减趋势，见图4。故 1h为最佳浸泡时间。
图 4浸泡时间单因素试验结果
2.4.4加水倍数初步考察
将提取次数固定为2次，提取时间固定为2 h，加水倍数分别按 8、10、12、14、16 倍进行提取，结
果综合评分在 8～10 倍呈增加趋势，在 10～14 倍呈递减趋势，见图5。故 10倍为最佳加水倍数。
图 5加水倍数单因素试验结果
2.5提取工艺优选
2.5.1响应面试验设计在单因素试验基础上，按处方量精密称取饮片，根据各因素的特点及影响程度，确定综合评分＝绿原
酸×0.4＋总黄酮×0.4＋浸膏得率×0.2（总黄酮＝芦
丁×0.5＋黄芩苷×0.5），选择提取时间（A）、浸泡时间（B）、加水倍数（C）为自变量，绿原酸、芦丁、黄芩苷含量为因变量，采用 Design-Expert8.0.4 软件Central Composite试验设计方案进行研究，结果见表1。
2.5.2模型的拟合采用方差分析对各因素进行多元二次回归，得回归方程 Y＝80.72＋1.56A＋0.70B＋2.79C－0.16AB＋
0.37AC－0.58BC－1.91A2－0.19B2－1.29C2。从表 2
可以看出，A、C、A2、C2 具有显著影响，影响程度为C＞A＞B；失拟项P＞0.05，表明失拟不显著；r＝
0.940 8，表明该模型拟合较好，试验误差小，可用该模型对不同条件下的试验结果进行测定。根据回归分析结果绘制三维响应面图，见图6。
2.5.3 验证试验通过对数据的综合分析，最佳提取工艺为：浸泡时间 63.28 min，加 12倍量水，提取时间 135.01 min；结合实际生产确定最佳工艺为浸泡60 min，加 12 倍量水，提取 130 min。按处方量称取 3份饮片，每份
176 g（其中金银花、槐花、黄芩各10 g），按优选的提取工艺进行3次验证试验，结果绿原酸、芦丁、黄芩苷平均质量浓度分别为 55.28、69.26、26.78 µg/g；浸膏得率为 33.72% ，综合评分与预测值的偏差为
1.66%，表明该二项式模型拟合效果良好，可信度较高。 3 讨论本研究在单因素试验中通过考察多个水平，筛选出各因素的最佳提取方案，缩小进入响应面设计试验的范围；在工艺的优选上，固定提取次数为2次，以
浸泡时间、加水倍数、提取时间为主要影响因素，3味君药主要成分的含量和浸膏得率的综合评分为指标，采用响应面法优选银槐解毒颗粒最佳水提工艺。从试验数据的综合分析可以看出，加水倍数和提取时间对该处方提取工艺有显著影响，且加水倍数的影响大于提取时间；浸泡时间对该处方提取工艺并无显著影响，考虑可能该处方中以花类药物为主，根茎类药材较少，故浸泡时间对综合评分无显著影响，与理论预期较为符合。在验证试验中发现，预测值与真实值比较接近，测定结果稳定，且3个成分的转移率分别为绿原酸 85.60% （处方中山楂和菊花也含有绿原
酸[8]）、黄芩苷 83.12%、芦丁 73.32%，表明优选的最佳水提工艺对3种指标性成分提取效率高，可以成为 中试生产的依据。
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（收稿日期：2017-06-13）
（修回日期：2017-07-17；编辑：陈静）