基于指纹图谱与一测多评技术分析化学转化法富集甘草药渣总黄酮的研究

2018-01-15 - 基金项目：兰州市科技发展计划项目（兰州市科技局2014-2-32）

刘效栓1，肖正国1，罗燕燕2，李喜香1，李季文1，毕映燕1，刘军刚 1

1.甘肃省中医院药学部，甘肃兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000摘要：目的建立指纹图谱与一测多评相结合的质量评价模式分析化学转化法富集的甘草药渣总黄酮，为生产中质量控制提供技术支撑。方法以破壁富集的总黄酮为研究对象建立指纹图谱，以甘草苷为内参物，分别建立异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸的相对校正因子，计算其含量。并对计算值与外标法测定值进行比较，以验证一测多评法的实用性与稳定性。结果建立了甘草药渣总黄酮HPLC指纹图谱，标定了11 个共有峰，确定了其中5 个共有峰，10批提取物相似度＞0.99；一测多评法计算结果与外标法实测值之间相对误

差＜4%，以多浓度法计算试验所得相对校正因子RSD＜2%。结论本方法准确可靠，专属性强，结果稳定，重复性好，可有效控制甘草药渣提取物的质量。关键词：指纹图谱；一测多评；甘草药渣提取物；质量评价

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.015

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)01-0069-05

Study on Enrichment of Total Flavonoids from Licorice Residue by Chemical Conversion Method Based on Fingerprint and Quantitative Analysis of Multi-components with a Single-marker Technique

LIU Xiao-shuan1, XIAO Zheng-guo1, LUO Yan-yan2, LI Xi-xiang1, LI Ji-wen1, BI Ying-yan1, LIU Jun-gang1

1. Pharmacy Department of Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China;

2. Pharmacy College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China

Abstract: Objective To establish a combined quality evaluation model of fingerprint and quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) to analyze the total flavonoids from licorice residue by the chemical conversion method; To provide technical support for quality control in production. Methods Total flavonoids of breaking cell wall and enriching were taken as the object of study to establish fingerprint. With liquiritin as internal reference, the relative correction factors of isoliquiritin, glycyrrhizin, isoliquiritigenin and glycyrrhizic acid were established respectively, and the contents were determined. Meanwhile, the calculated values were compared with the measured value by external standard method to verify the practicability and stability of QAMS. Results The HPLC fingerprint of total flavonoids from licorice residue was established. 11 common peaks were identified, and 5 common peaks were identified, and the similarity of the 10 extracts was >0.99; the relative error between the calculated results of QAMS and the measured values of the external standard method was <4%; the RSD of relative correction factor calculated by the multiple concentration method was <2%. Conclusion The method is accurate, reliable, specific, and stable, with good repeatability, which can be used for the quality control of total flavonoids from licorice residue.

Keywords: fingerprint; quantitative analysis of multi-components with a single-marker; licorice residue extract; quality evaluation 中药指纹图谱指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体化学特性的色谱或光谱图。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）新收载特征图谱 28 个品种，其中提取物 3 个品种、中药材 2 个品种、中成药 23 个品种；新收载指纹图谱 9 个品种，均为中成药品种[1-3]。目前，指纹图谱已广泛应用到药材的真伪优劣鉴别及新药生产过程

的质量控制中[4-6]。对于市场上通过加入单一成分达到现有质量标准的伪药，采用指纹图谱进行多成分的全面控制切实可行。

一测多评方法（QAMS）又称一标多评法，是指在含量测定时，只使用一个对照品，可同时计算出供试品中其他待测成分的含量，使其计算值与实测值符

合定量方法学研究的要求。目前，美国药典（USP33）收载的 108 个植物药标准（13种植物）中 36 个使用

校正因子，欧洲药典（EP7.0）在 232 个植物药标准中 11 个使用了一测多评，2015 年版《中华人民共和

国药典》593 个植物药标准（9 种植物）通过相对保留时间及对照药材（或对照提取物）的特征图谱确认

色谱峰，进而根据相对因子计算其他色谱峰的含量[7]，如黄连（小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马亭含量测定）、丹参、生姜、银杏提取物等。

甘草具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。随着对甘草药理作用的进一步认识，全

世界对甘草的需求日益增长，甘草资源急剧减少[8]。本课题前期进行了“基于化学转化法破壁富集甘草药渣中总黄酮的开发研究（兰州市科技局人才创新创业项目 2014-2-32）”，完成了提取工艺试验及中试研究。本试验以甘草药渣提取物为研究对象，建立指纹图谱，并构建一测多评法测定提取物中5种成分的含量，对甘草药渣提取物进行质量控制。1 仪器与试药

高效液相色谱仪（包括 Waters1525 二元泵、

Waters717 进样器、Waters2487 双通道紫外检测器、Breeze 工作站）； Mettler AE240 电子分析天平；

SB-3200D 型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

甘草素对照品（批号 B-20416）、异甘草素对照品（批号 B-21525）、甘草苷对照品（批号 B-20414）、异甘草苷对照品（批号 B-21524 ）、甘草酸对照品

（B20417），上海源叶生物科技有限公司；甘草饮片（批号 150922、150701），甘肃康乐药业有限责任公司，经甘肃省药检院宋平顺主任药师鉴定为Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎；甘草药渣提取物 10批（批号分别为 20160504、20160505、

20160506、20160509、20161102、20161104、20161108、

20161107、20161114、20161126），甘肃省中医院制剂室提供，制备过程见文献[9]。无水乙醇（批号

20160905 ）、乙腈（批号 20160505 ）、磷酸（批号

20160307）均为色谱纯，天津市大茂化学试剂厂；含量测定用水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 定量分析方法验证

2.1.1 色谱条件

色谱柱为岛津 Inerisil ODS-3（250 mm×4.6 mm，

5 µm），乙腈为流动相A，0.85%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（见表 1），柱温 25 ℃，检测波长 237 nm，流速 1 mL/min。

2.1.2混合对照品的制备分别精密称取对照品甘草苷 5.1 mg、异甘草苷

6.6 mg、甘草素 5.6 mg、甘草酸 5.6 mg、异甘草素

5.3 mg，用70%乙醇溶解并定容至 25 mL，得到浓度分别为 0.204、0.264、0.224、0.224、0.212 mg/mL 的单一对照品溶液，分别精密吸取 2.0、2.0、0.5、2.0、

1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得浓度分别为 0.040 8、0.052 8、0.011 2、0.044 8、0.021 2 mg/mL

的混合对照品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.1.3 供试品溶液的制备取甘草药渣提取物约100 mg，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加70%乙醇至刻度，精密称定，超声处理

（180 W，40 kHz）30 min，冷却，称定补足减失的

质量，0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样分析，结果各成分色谱峰分离度良好。色谱图见图1。

2.1.5 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液 0.5、1、5、10、

15 µL进样，在上述色谱条件下记录色谱峰面积，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，计算回归方

程。甘草苷：Y＝2 296 046.078X－10 769.500，r＝

0.999 98，线性范围 0.020 4～0.612 0 µg；异甘草苷：

Y＝1 361 314.394X－7737.500，r＝0.999 91，线性范围

0.026 4～0.792 0 µg；甘草素：Y＝5 011 214.286X－

15 122.500，r＝0.999 83，线性范围 0.005 6～0.168 0 µg；

甘草酸：Y＝661 750.893X－8479.500，r＝0.999 69，线性范围0.022 4～0.672 0 µg；异甘草素：Y＝1 976 024.528X－

7840.000，r＝0.999 95，线性范围 0.010 6～0.318 0 µg。各成分在线性范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液10 µL，连续进样 6次。结果甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素峰面积 RSD 分别为 0.66%、1.52%、0.81%、0.59%、

0.71%；以甘草苷（4 号峰）为内参物s，其他共有峰相对保留时间为 ras＝tRa/tRs，RSD 分别为 0.72%、

0.52%、0.40%、0.46%、0.42%，共有峰相似度达 1.000。

2.1.7 稳定性试验取同一批供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、

24 h 进样 10 µL，记录峰面积，RSD分别为 0.65%、

1.56%、1.85%、0.95%、0.65%，表明供试品溶液在

24 h内基本稳定。

2.1.8 重复性试验

取同一批提取物6份，约 100 mg，精密称定，按

“2.1.3”项下方法制备 6份，进样10 µL，记录峰面积。甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素平均含量分别为 8.981、2.770、0.401、5.334、0.611 mg/g，峰面积 RSD 分别为 0.68%、1.08%、1.58%、0.90%、

1.25%，相似度 1.000，符合指纹图谱要求。

2.1.9 加样回收率试验取已知含量的同一批样品（批号 20160506）6 份，约 60 mg，精密称定，每份加入约1 mL混合对照品

溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样10 µL分析。计算甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸及异甘草素平均加样回收率分别为

00.1%、100.8%、102.2%、103.6、99.2%，RSD 分别为 1.80%、1.01%、0.85%、1.47%、1.22%。

2 指纹图谱分析

2.1 指纹图谱的建立按照中药指纹图谱要求，对10批样品进行检测，其所有成分在80 min内全部出完。采用《中药色谱指

纹图谱相似度评价系统》（2012.130723 版），将 10 批样品 HPLC图谱数据导入软件，进行相似度分析，生

成对照图谱。以甘草苷（4号峰）为参照，11个共有峰的保留时间和峰面积见表2。对照图谱见图2。

2.2.2 相似度评价

以 S1 样品的指纹图谱作为参照图谱，用平均数法生成 10批样品的对照指纹图谱（见图3），10 批样品与对照指纹图谱相似度分别为 1.000、1.000、1.000、

1.000、1.000、0.999、0.998、1.000、0.999、1.000。

2.3 一测多评法分析

2.3.1 5种化合物相对校正因子测定

取“2.1.2”项下混合对照品溶液，分别进样 1.0、

2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 µL，记录甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素的峰面积，以甘草苷为内参物s，采用多浓度计算法，计算相对校正因子。fsi＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）。fs为甘草苷绝对校正因

子，fs6、fs8、fs10、fs11 分别为异甘草苷、甘草素、甘草酸、异苷草素的相对校正因子。结果见表3。

2.3.2相对校正因子重现性考察

采用 Waters2487 考察3种不同型号色谱柱，用岛津 Inerisil ODS-3 色谱柱考察 2 种色谱系统对相对校

正因子的影响，结果重现性良好，RSD＜5%，见表4。

2.3.3 一测多评法与外标法比较

取 10 批甘草药渣提取物，按“2.1.3”项下方法制备，进样 10 µL 测定，分别采用外标法和 QAMS法计算5种成分的含量，结果见表5。

3 讨论甘草有效成分主要为甘草酸和黄酮类化合物。目前对甘草中的甘草酸进行开发、生产的利用率不超过 30%，其余则作为废渣丢弃[10-11]。本试验在前期研究基础上建立指纹图谱及一测多评的分析方法，为大规模生产开发甘草药渣提供依据。

试验过程中，选择双通道双波长同时扫描，得到同步双谱图，经比较发现 λ237色谱图与 λ254色谱图基本接近，但甘草苷在 λ237处有最大吸收，保留时间为

（14.953±0.258）min。以甘草苷作为内参物，符合

易得、稳定、定位准确、重复性好的原则[3]，故选择

λ237为测定波长。

有文献报道采用变波长法测定[10]。本试验发现变波长测定时背景吸收不易控制、基线不平，且由于特征峰较多，实际操作有困难。本研究最大限度参考药典数据及方法，方便实际操作，耐用性符合要求。

目前已有文献报道从甘草药渣中分离并鉴定了

甘草查耳酮等多种成分[12-14]，但本试验所用到的样品中尚未发现含有甘草查耳酮B，有待进一步分析考察。

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