甘肃不同产地红芪中总黄酮及总多糖含量测定研究

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杨秀娟1,杨志军 1,2,牛鹏贤 1,潘子昱1,邵晶1,李硕 1,2

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室,甘肃 兰州 730000摘要:目的 建立甘肃不同产地红芪中总黄酮及总多糖的含量测定方法。方法 采用紫外分光光度法,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葡萄糖为对照品,在波长分别为 260、484 nm 处测定甘肃不同产地红芪中总黄酮和总多糖的含量。结果 甘肃不同产地红芪中总黄酮含量在 2.82~6.79 mg/g之间,平均加样回收率为97.96%;总多糖含量在 106.14~746.40 mg/g 之间,加样回收率为 102.90%。结论 甘肃不同产地红芪中总黄酮、总多糖含量存在差异,采用紫外分光光度法测定红芪中总黄酮、总多糖含量的方法操作简便,重复性好,准确可靠,可作为红芪中总黄酮和总多糖的测定方法。关键词:红芪;紫外分光光度法;毛蕊异黄酮苷;葡萄糖;总黄酮;总多糖

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.018

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)02-0079-04

Content Determination of Total Flavones and Polysaccharides in Hedysari Radix in Different Producing Areas in Gansu Province

YANG Xiu-juan1, YANG Zhi-jun1,2, NIU Peng-xian1, PAN Zi-yu1, SHAO Jing1, LI Shuo1,2

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese and Tibetan Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

Abstract: Objective To establish a method for content determination of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province. Methods The contents of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province were determined by ultraviolet spectroscopy with calycosin-7-glucoside and glucose as reference substance, and the wavelength was set at 260 nm and 484 nm. Results The contents were from 2.82 mg/g to 6.79 mg/g for total flavones and from 106.14 mg/g to

746.40 mg/g for total polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province. The recoveries of total flavones and total polysaccharides were 97.96% and 102.90%, respectively. Conclusion There was difference in contents of total flavones and polysaccharides of Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province, and the method of using ultraviolet spectroscopy is simple, reproducible, accurate and reliable, which can be preferably used as the method for content determination of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix.

Keywords: Hedysari Radix; ultraviolet spectroscopy; calycosin-7-glucoside; glucose; total flavones; total polysaccharides

红芪是豆科植物多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根,其性微温,味甘,归脾、肺经,具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌功效[1]。红芪最早记载于《神农本草经》黄芪项下,并列为上品。在历代本草文献中,黄芪项下的“赤水耆”和“赤

基金项目:甘肃省教育厅高等学校科研项目(2016B-055、

2016B-054、2017A-056);甘肃省财政厅高等学校基本科研业

务费项目(2013-1)

通讯作者:李硕,E-mail:290608323@qq.com 色者”即西北地区应用历史悠久的红芪,并认为红芪

是黄芪的优良品种[2]。自 1985 年版《中华人民共和国药典》开始,将红芪单列出来。

红芪现主要分布在甘肃陇南、天水和定西等地区,一般被认为是甘肃道地药材,为甘肃十大陇药之一,具有悠久的生产历史。红芪的化学成分主要有黄酮类、皂苷类、生物碱类、氨基酸类、有机酸类及多糖及微量元素等。红芪的药理作用也比较广泛,主要有提高免疫力、强心、利尿、抗病毒、抗自由基、抗肿瘤、抗炎、抗衰老、保肝、调节血糖和调节血脂作

用[3-5]。

本课题前期研究建立了甘肃不同产地红芪的指

纹图谱,并采用一测多评法进行了红芪的含量测定[6]。本试验以葡萄糖和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为对照品,采用紫外分光光度法对甘肃10个产地11批红芪中总黄酮及总多糖的含量进行测定,比较甘肃不同产地红芪中总黄酮、总多糖含量的差异,为红芪质量的整体评价控制及其资源的合理开发利用提供参考依据。1 仪器与试药

UV Bluestar B紫外-可见分光光度仪(北京莱伯

泰科技有限公司),电子天平(ALC-210.4,Acculab),十万分之一电子天平(BT 125D,德国赛多利斯科学

仪器有限公司),超声清洗仪(SB25-12 DTD,宁波新芝生物科技股份有限公司),循环水式真空泵(SHZ-DⅢ,巩义市子华仪器有限责任公司),干燥

箱(101A-1,上海市实验仪器总厂)。葡萄糖、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号分别为 PY150812RM、PY150828RM,南京普怡生物科技有限公司,纯度99%),无水乙醇(分析纯),乙醇(分析纯),双蒸水。

11批红芪样品分别采自甘肃武都、陇西、甘谷和武山等 10 个产地,经甘肃中医药大学药学院李成义教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根,样品来源见表 1。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷适量,加70%乙醇制成 0.100 0 mg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液。取上述对照品溶液 1、1.5、2、3、4 mL,分别置于 25 mL量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,摇匀,制得浓度分别为 0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.012 0、

0.016 0 mg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品稀释液。

精密称取 105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量,加蒸馏水制成 0.100 0 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 总黄酮供试品溶液取红芪样品粉末(过2号筛)约 0.15 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入70%乙醇 25 mL,称定质量,超声处理(功率 500/600 W,频率 40 kHz)1 h,放冷,再称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.2.2 总多糖供试品溶液取红芪样品粉末(过2 号筛)约 0.2 g,精密称定,用 50 mL乙醇溶液浸泡,超声提取(功率 500/600 W,频率 40 kHz)2 次,设置温度为80 ℃,每次 20 min (以去除单糖和低聚糖);过滤后,将滤渣用 50 mL蒸馏水超声提取(功率 500/600 W,频率 40 kHz)2次,每次 20 min,合并 2次滤液,移至 100 mL量瓶中,将残渣用水洗涤2次,洗液并入量瓶中,定容,作为供试品溶液。精密吸取 200 μL 供试品溶液,加入蒸馏水 1.8 mL、5%苯酚溶液 1.0 mL,迅速滴加浓硫酸 5.0 mL,摇匀后静置 5 min,置沸水浴中加热

15 min,取出,冷却至室温,用紫外分光光度计测定

其吸光度[7-10]。

2.3 紫外检测波长的确定取适中浓度毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葡萄糖对照品溶液及供试品溶液,在 200~1000 nm范围内进行全波长扫描。结果表明,毛蕊异黄酮葡萄糖苷和红芪总黄酮均在 260 nm处有最大吸收,葡萄糖和红芪总多糖均在 484 nm处有最大吸收。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

取“2.1”项下不同浓度毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液,用参比溶液调零,用适当浓度对照品溶液在

紫外区间(400~190 nm)进行峰值检测,总黄酮最大吸收峰在 260 nm处。在 260 nm处测定各对照品溶液吸光度(A),以毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度(C)为横坐标,A为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程 A=52.36C+0.007,r=0.999 9(n=6)。结果表明,毛蕊异黄酮葡萄糖苷在 0.004~0.016 mg/mL 范围内线性关系良好。

精密吸取“2.1”项下葡萄糖对照品溶液 0.2、0.3、

0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于 10 mL试管中,分别加水至1.0 mL,另取一试管作为空白对照,加水1.0 mL,分别加5%苯酚 1.6 mL,摇匀,然后快速滴加浓硫酸

7.0 mL,摇匀后静置5 min,置沸水浴中加热 15 min,

取出后冷却至室温,于 484 nm处测定各对照品溶液吸光度,以浓度对吸光度进行回归。以浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程 A=11.20C-0.022,r=0.999 0(n=7)。结果表明,葡萄糖在 0.020~0.080 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度考察精密吸取浓度分别为0.008 0 mg/mL、0.100 0 mg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葡萄糖对照品溶液,毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液按总黄酮线性关系考察方法在 260 nm 波长处重复测定 6 次,计算得 RSD=

0.78%,葡萄糖对照品溶液显色后在 484 nm波长处重复测定 6次,计算得 RSD=0.32%,表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考察分别精密称取同一产地(武都)红芪样品粉末 6

份,按“2.2”项下方法制备总黄酮和总多糖供试品溶液,分别在 260、484 nm波长处进行测定。结果总黄酮平均含量为 3.68 mg/g,RSD=0.49%,总多糖平均含量为 300.02 mg/g,RSD=1.29%,表明本方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察精密吸取同一产地(武都)红芪供试品溶液,分别于 0、2、4、6、8、12 h 在 260 nm波长处进行测定,测得总黄酮含量的 RSD=0.92%,表明供试品溶液在

12 h内稳定。

2.4.5 显色稳定性考察精密吸取显色后葡萄糖对照品溶液、显色后同一产地(武都)红芪供试品溶液,分别于 0、15、30、

45、60、90、120 min 在 484 nm波长处进行测定,测得显色后葡萄糖对照品溶液及供试品溶液的 RSD 分别为 1.98%、1.26%,表明显色后的对照品溶液和供试品溶液在2h内稳定。

2.4.6 加样回收率试验精密称取已测定的样品6份,每份 0.075 g,分别

加入一定量的对照品溶液(0.100 0 mg/mL),按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按260 nm波长处进行测定。结果总黄酮的加样回收率分别为97.57%、98.51%、

98.30%、96.83%、98.76%、97.81%,平均加样回收率为 97.96%,RSD=0.72%,表明本方法的准确度良好,见表2。

精密称取已测定的样品6份,每份 0.1 g,分别加

入一定量的对照品溶液(0.100 0 mg/mL),按“2.2”项下方法制备供试品溶液,在484 nm波长处进行测 定。结果总多糖的加样回收率分别为96.21%、98.39%、100.19%、99.50%、96.79%、98.00%,平均加样回收率为 98.18%,RSD=1.56%,表明本方法的准确度良好,见表3。

2.5 样品含量测定取甘肃不同产地红芪样品粉末(过 2 号筛)约

0.15~0.2 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备总黄

酮和总多糖供试品溶液,并分别按上述“2.4.1”项下方法操作,分别在260 nm和 484 nm波长处进行测定,将所测得的吸光度值代入回归方程,计算总黄酮和总多糖含量,每份样品平行 3 份,取其平均值。结果见表4、图 1、图 2。

3 讨论本试验采用紫外分光光度法对红芪总黄酮的检

测过程进行摸索,参照文献[11-13],选用芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷2个对照品,在 200~1000 nm范围内进行全波长扫描,结果在相近浓度的情况下,毛蕊异黄酮葡萄糖苷吸光度明显大于芒柄花苷吸光度。说明毛蕊异黄酮苷在波长 260 nm处吸收更强,故选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷为含量测定对照品。在制备红芪总黄酮供试品溶液的过程中对样品提取方法(回流和超

声)、提取溶剂(70%乙醇和甲醇)、提取时间(30、

60、30 min,2次)进行了筛选。结果表明,采用回流提取与超声提取红芪总黄酮含量相当,考虑超声提取方法简便、高效,故采取超声提取工艺;采用70%乙醇提取略优于甲醇提取,提取时间为60 min。

红芪中含有丰富的多糖,本研究采取红芪样品粉末先用乙醇溶液浸泡,再超声提取,并将温度设至

80 ℃,滤渣再重复以上操作,最后转移至量瓶中并定容,该方法能有效提取红芪多糖。

红芪为甘肃地产特色药材,在甘肃陇南资源丰富,本试验收集了甘肃10 个产地 11批红芪药材,采用紫外分光光度法测定甘肃不同产地红芪中总黄酮、总多糖的含量。结果表明,该测定方法稳定、重复性好、可靠性高;红芪中总黄酮含量在 2.82~6.79 mg/g 之间,不同产地样品的含量有较大差异,其中武山、甘谷、岷县产红芪中总黄酮含量较高,礼县产红芪中总黄酮含量最低;红芪中总多糖含量在 106.14 ~ 746.40 mg/g之间,其中礼县、渭源栽培、西和产红芪中总多糖含量较高,而岷县产者含量最低。

近年来,红芪等补益类药材的研究应用受到了广泛关注,其需求量逐年增加,红芪的有效开发利用具有重要的研究意义。本试验为红芪的质量综合评价及控制提供了参考依据。红芪不同产地质量差异及其影响因素、质量评价控制指标的确定与其药效的相关性还有待于进一步研究。

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(收稿日期:2017-04-01)

(修回日期:2017-05-08;编辑:陈静)

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