CJI (Traditional Chinese Medicine)
温针灸对神经痛大鼠脊髓白细胞介素-6及细胞信号转导抑制因子3的影响
俞向梅1，杨意州1，刘建波1，李长征1，龚德贵2，王志福 1
1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003摘要：目的 观察温针灸对神经痛大鼠脊髓白细胞介素-6（IL-6）、细胞信号转导抑制因子3（SOCS3）的影响，探讨其治疗神经痛的作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、温针组、IL-6 组，每组 6只。模型组建立坐骨神经慢性限制性损伤神经痛模型，不干预；温针组造模成功第5日后，选取“脾俞”“肾俞”温针灸治疗，共10 次；IL-6 组造模成功第5日起，脊髓鞘内注射重组IL-6，共 3次。电子触觉测量机械痛行为学，ELISA 和 RT-PCR 检测脊髓 IL-6、SOCS3 mRNA及小胶质细胞活化标记物 Iba-1 的表达。结果 与
模型组比较，温针组机械痛阈值明显升高（P＜0.01），Iba-1 含量明显降低（P＜0.01），脊髓背角 IL-6 mRNA
表达明显降低（P＜0.01），SOCS3 mRNA 表达明显升高（P＜0.01）。结论 温针灸能减轻神经痛大鼠痛敏反应，其机制可能与抑制脊髓小胶质细胞活化、下调IL-6 表达和上调 SOCS3 表达有关。
关键词：神经病理性疼痛；温针灸；脊髓；白细胞介素-6；细胞信号转导抑制因子3；神经炎症；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.014
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)03-0064-04
Effects of Warming Acupuncture Therapy on Expressions of IL-6 and SOCS3 in Spinal Cord in Rats with Neuropathic Pain
YU Xiang-mei1, YANG Yi-zhou1, LIU Jian-bo1, LI Chang-zheng1, GONG De-gui2, WANG Zhi-fu1
1. Integrative Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China; 2. Subsidiary Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China
Abstract: Objective To observe effects of warming acupuncture therapy on expressions of IL-6 and SOCS3 in spinal cord in rats with neuropathic pain; To discuss its mechanism for treating neuropathic pain. Methods Experimental rats were randomly divided into: normal group, model group, warming acupuncture and IL-6 group, with 6 rats in each group. Sciatic nerve chronic constriction injury neuralgia model was established in the model group, without intervention. After modeling for 5 days in the warming acupuncture group, “Pishu” and “Shenshu” acupoints were chosen for warming acupuncture therapy for 10 times. After modeling for 5 days in the IL-6 group, IL-6 group was successfully intrathecally injected 3 times with recombinant IL-6. After finishing all experiments, the mechanical pain behavior was measured with electronic Frye fibers. The mRNA levels of IL-6 and SOCS3 and protein concentration of spinal Iba-1were detected with ELISA and RT-PCR analysis. Results Compared with model group, mechanical withdrawal thresholdsin the warm acupuncture group significantly increased, and the content of Iba-1 decreased significantly (P<0.01); The mRNA level of IL-6 decreased significantly (P<0.01), and the mRNA level of SOCS3 significantly increased (P<0.01). Conclusion Warming acupuncture therapy can reduce the pain response in rats with neuropathic pain through inhibiting spinal cord microglial activation, down-regulating the gene expression of lL-6 and up-regulating the gene expression of SOCS3.
Keywords: neuropathic pain; warming acupuncture therapy; spinal cord; IL-6; SOCS3; nerve inflammation; rats
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81774385）；福建省教育厅中青年教师科研项目（JA15250）；福建省高校杰出青年科研
人才项目（2015年）；福建省卫计委青年科研课题项目（2015-1-79）；福建省自然科学基金青年创新项目（2015J05163）；福建省
自然科学基金（2016J01391）
通讯作者：王志福，E-mail：wzf993002@163.com
神经病理性疼痛（简称“神经痛”），是由躯体感觉神经系统的损伤或相关疾病而造成的疼痛。按国际上神经痛发病率约 8%推算，中国约有 0.9 亿神经痛患者。有研究显示，温针灸脾俞、肾俞有健脾益肾、活血化瘀的功效，对各种神经痛具有明显的镇痛作
用[1-3]。本课题组前期研究表明，神经痛发生时，脊髓中枢出现明显的神经炎症现象，且与脊髓白细胞介
素（IL）-6、细胞信号转导抑制因子 3（SOCS3）表
达存在密切联系[4-5]。本实验观察温针灸对神经痛大鼠机械痛敏反应及 IL-6、SOCS3 表达的影响，探讨其治疗神经痛的作用机制。
材料与方法
1.1 动物
SPF 级雄性 SD 大鼠 24 只，5～6 周龄，体质量
200～220 g，上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物许可证号 SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学 SPF级实验动物中心，分笼适应性喂养1 周，将大鼠称重并编号。所有实验均遵照国际动物保护和使用指南的规定实施。
1.2 主要试剂与仪器
4-0 铬制羊肠线，上海浦东金环医疗用品股份有
限公司；华佗牌一次性针灸针（0.28 mm×15 mm）、清艾条，苏州医疗用品厂有限公司；Recombinant Rat
IL-6（货号 400-06），美国 PeproTech（派普泰克）公
司；IL-6、SOCS3、GAPDH 引物，生工生物工程（上
海）股份有限公司合成。IQ5多重实时荧光定量PCR仪器，美国 Bio-Rad 公司；38450-电子触觉测量仪（电子 Von Frey），意大利 Ugo Basile 公司。
1.3 分组及造模采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、温针组和 IL-6 组，每组6只。模型组建立坐骨神经慢性限制性损伤（CCI）神经痛模型，不干预；温针组造模成功第 5 日起，选取“脾俞”“肾俞”温针灸治疗，每日1次，共 10 次；IL-6 组造模成功第5日起，脊髓鞘内注射重组 IL-6，共 3 次。参考文献[4-5]方法制作 CCI 神经痛模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛
（4 mL/kg）麻醉，右侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段用4-0 铬制羊肠线松扎四道，致CCI神经痛大鼠模型，术后用青霉素粉末预防感染。模型建立后，术后第5、14 日观察实验大鼠机械痛行为学变化。
1.4 温针灸干预
针灸穴位参照大鼠穴位图谱[6]，取双侧“脾俞” （大鼠第 12胸椎旁开7 mm）、双侧“肾俞”（大鼠第
2 腰椎旁开 7 mm）温针灸治疗。安静环境、室温
（20±2）℃，将大鼠躯干固定于木架上，头部与四肢可自由活动，静置20 min，将一次性针灸针刺入穴位，针刺后在针尾上搓捏少许艾绒点燃施灸，只待燃尽，除去灰烬，留针30 min后取针。正常组自由饮食活动，不进行任何干预。
1.5 鞘内注射白细胞介素-6大鼠取俯卧位，实验者食指定位于大鼠脊柱 L5-6间隙，右手持微量注射器从间隙垂直缓慢进针，以大鼠尾巴出现颤动或突然的侧向甩动作为穿刺成功的标志，注入相应药物。在第5、10、14 日，鞘内注射
20 ng/μL 重组 IL-6 溶液，10 μL/次。
1.6 观察指标
1.6.1 机械痛行为测试
测试环境为10 cm×20 cm×20 cm有机玻璃笼，将大鼠放入笼内静置10 min，采用电子 Von Frey 法进行检测，即利用不同强度的纤毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠缩爪反应。最小能引起缩爪反应的纤毛压力即为大鼠的缩爪反应阈值（g），以此反应大致的机械痛敏情况。
1.6.2 脊髓小胶质细胞标记物 Iba-1、白细胞介素-6、细胞信号转导抑制因子3 检测
第14日全部实验结束后，迅速新鲜取材脊髓（L4-5
节段）背角置于液氮中，-80 ℃冰箱保存待测。ELISA 检测脊髓小胶质细胞标记物 Iba-1 表达。
①取脊髓背角组织匀浆离心，提取上清液；②96孔酶标板上加样，每孔加入标准品或待测样品100 μL，将反应板混匀后置37 ℃ 40 min；③用洗涤液将反应板洗涤 4～6 次，滤纸上印干；④每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外）。将反应板混匀后置 37 ℃ 20 min；⑤按步骤③再次洗板；⑥每孔加酶标抗体工作液 100 μL。将反应板置 37 ℃ 10 min，如前步骤再次洗板；⑦每孔加入底物工作液100 μL，置
37 ℃暗处反应15 min；⑧每孔加入 100 μL终止液混
匀，30 min 内于酶标仪 450 nm处测吸光度，画出标准曲线，根据样品OD值计算出相应 Iba-1 含量。
RT-PCR 检测脊髓 SOCS3、IL-6 mRNA 表达。组织总 RNA 提取：冰浴取出新鲜脊髓背角组织，每
50～100 mg组织加1 mL Trizol 试剂，冰浴超声匀浆
15～20 s；每 1 mL Trizol 试剂加 0.2 mL氯仿，快速震荡 15 s，冰浴 5 min，4 ℃、12 000×g 离心 15 min；加与水等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，冰浴15 min，
4 ℃、12 000×g 离心 10 min，弃上清，吸干异丙醇；加75%乙醇，重悬沉淀，4 ℃、7500×g 离心 8 min，
弃上清，消毒滤纸上吸干乙醇；重复以上步骤，倾去乙醇，空气干燥；干燥后将沉淀溶于 DEPC 水，置
70 ℃贮存，沉淀加乙醇于20 ℃可长期贮存；取4 μL总RNA溶液稀释至1 mL，紫外分光光度计检测OD260和 OD280值，测定其浓度和纯度。反转录合成 cDNA第一链：PCR管中依次加入 Total RNA、Oligo（dT）
15 primer、DEPC H2O（Rnase-free），70 ℃变性5 min，冰浴 5 min；随后加入 5×M-MLV Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs、RNase inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、DEPC H2O，37 ℃水浴 60 min，95 ℃水浴 5 min, 冰浴 5 min。PCR 扩增：PCR管依次加入
2×Taq PCR Master Mix、Sense primer、Antisense primer、反转录产物、dd H2O，混匀，瞬时离心。94 ℃
5 min，94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，
72 ℃ 10 min；实时荧光定量 PCR仪进行样本分析。
1.7 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，符合正态分布用方差分析，不符合正态分
—
布用秩和检验中独立样本比较。检验水准α＝0.05。2 结果2.1 温针灸对模型大鼠机械痛行为的影响与正常组比较，模型组大鼠造模后第 5、14 日，
机械痛阈值明显降低（P＜0.01）；造模后第 14 日与模型组比较，温针组大鼠机械痛阈值明显升高（P＜
0.01），IL-6 组大鼠机械痛阈值明显降低（P＜0.01)。结果见图1。
—
2.2 温针灸对模型大鼠脊髓小胶质细胞标记物 Iba-1的影响
术后第 14 日，与正常组比较，模型组大鼠脊髓
Iba-1 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，温针组大鼠脊髓 Iba-1 含量显著降低（P＜0.01），IL-6 组大鼠脊髓 Iba-1 含量显著升高（P＜0.01）。结果见图 2。 2.3 温针灸对模型大鼠脊髓白细胞介素-6、细胞信号转导抑制因子3 mRNA表达的影响
术后第 14 日，与正常组比较，模型组大鼠脊髓
IL-6、SOCS3 mRNA 表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，温针组大鼠脊髓 IL-6 mRNA 表达显著降
低，SOCS3 mRNA 表达显著升高（P＜0.01），IL-6组大鼠脊髓 IL-6 mRNA 表达显著升高（P＜0.01），
SOCS3 mRNA 表达显著降低（P＜0.01）。结果见图 3。 3 讨论神经痛可归属中医学“痹证”范畴。灸法是一种温热刺激，有温经散寒、扶阳固脱、活血化瘀的功效，正如《灵枢•官能》“针所不为，灸之所宜”。肾俞为肾的背俞穴，具有疏经益气、补肾益精作用；脾俞为脾之背俞穴，具有健脾益气通络作用。大鼠脾俞、肾俞解剖深层邻近肾上腺免疫器官，针灸肾上腺邻近背俞穴（脾俞、肾俞），刺激相应节段交感神经纤维，可影响神经递质或激素释放，调节机体免疫功能。
在神经痛的发生及发展中，外周神经损伤刺激达一定阈值时，脊髓胶质细胞激活可释放炎性因子
（IL-6、IL-1β 等），参与维持脊髓中枢敏化状态，并
出现“神经炎症”现象[7-8]。SOCS3 作为 SOCS 家族蛋白中的重要一员，在周围神经损伤及神经炎症中发挥重要的作用；坐骨神经损伤SOCS3 表达不断升高，
抑制周围神经巨噬细胞的聚集；IL-6作为多功能细胞
因子，参与炎症及神经痛的发生发展过程[9-10]。SOCS3作为 IL-6 信号通路的首要抑制剂，可通过结合 IL-6受体亚基 gp130 或 JAKs 蛋白，从而抑制炎症反
应[11-12]。有研究显示，神经痛发生时，CCI 大鼠脊髓小胶质细胞显著激活，脊髓IL-6 表达显著上调，应用小胶质细胞抑制剂米诺环素可显著抑制IL-6 表达，减
轻机械痛觉过敏[13]。此外，小胶质细胞高表达 SOCS3蛋白可抑制 JAK/STAT3 信号通路，降低 IL-6 表达，
减轻神经炎症反应[14]。
前期研究表明，在 CCI 大鼠中，SOCS3 存在于小胶质细胞中，电针可抑制脊髓胶质细胞活化，并进一步上调胶质细胞中 SOCS3 表达水平，并反馈性抑制 IL-6 细胞因子释放，发挥抗炎镇痛作用[5]。本实验结果也显示，神经痛发生时，脊髓小胶质细胞显著激活，脊髓 IL-6 表达显著上调，鞘内注射 IL-6 可降低
SOCS3 mRNA 表达，进一步加剧痛敏反应；温针灸效果类似电针，可显著抑制脊髓小胶质细胞的活化，上调脊髓 SOCS3 mRNA表达，降低脊髓 IL-6 释放，从而减轻机械痛敏反应。
综上所述，温针灸“脾俞”“肾俞”能减轻 CCI大鼠机械痛敏化反应，可能与降低脊髓神经炎症、促进脊髓 SOCS3 表达有关，但其具体作用机制有待于今后深入研究。
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（收稿日期：2017-09-22）
（修回日期：2017-10-25；编辑：华强）