基于多元统计分析的3种法定基源黄精化学成分比较研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Tcm -

4 讨论对于糖苷类成分而言,苷元是肠道菌群代谢的主要产物。本试验中,大鼠肠道菌群对 TBⅡ有较强的代谢作用,孵育8h时转化率即达到 92%,24 h 时已检测不到 TBⅡ,将代谢产物用甲醇复溶后可以检测到浓度很高的 TAⅢ;同时,薄层色谱鉴定显示,样品与对照品在相同位置上显相同颜色的斑点。由此可以初步判定TBⅡ的大鼠肠道菌群代谢产物为TAⅢ,即TBⅡ失去一分子糖,其可能的代谢途径见图8。

中药绝大多数通过口服吸收而发挥药理作用,对于糖苷类药物而言,通常在肠道内很难吸收,生物利用度低,原型药理活性小,需经过肠道菌群的作用,发生代谢转化后发挥其药理活性,被认为是“天然前体药物”。近年来,关于TAⅢ抗肿瘤的研究报道很多, TA Ⅲ可以诱导人乳腺癌 BT474 及乳房上皮细胞

MCF10A的凋亡[3];能通过线粒体自我吞噬诱发HeLa

癌细胞凋亡[4],TAⅢ对黑色素瘤 B16 和 A375、人脑胶质瘤及人胰腺癌 PANC-1 细胞均具有凋亡作用[5-9]。King F W等[3]研究表明,TBⅡ无抗肿瘤活性,但TAⅢ能诱导多种肿瘤细胞凋亡,且对正常细胞无影响。本研究也比较了TBⅡ、TAⅢ两者的抗肿瘤活性,结果显示TAⅢ对胰腺癌PANC-1细胞有较强的抑制作用,浓度为 30 μg/mL 时抑制率达97%。可见,TAⅢ具有较高的抗肿瘤药理活性。然而,知母中 TBⅡ含量较

高,2015 年版《中华人民共和国药典》规定不少于

3.0%,文献报道最高达 10.25%[10];本研究测定结果 显示,TAⅢ含量较少,仅为TBⅡ的 1/20。本研究结果表明,TBⅡ可较高效率地转化为抗肿瘤活性更强的TAⅢ。这就提供了一种研究思路,即将TBⅡ在体外转化为TAⅢ,本研究为体外大量制备TAⅢ提供了参考与技术支持。

TBⅡ易被大鼠肠道菌群代谢,掌握口服后其在体内的代谢转化规律,可为深入理解其药理作用机制提供帮助,并且,其代谢产物 TAⅢ的抗肿瘤药理活性远大于 TBⅡ,将其活性代谢产物制成制剂入药,是否能增加药物的生物利用度和药理活性,值得进一步深入研究。

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(收稿日期:2017-11-03)

(修回日期:2017-12-25;编辑:陈静)

杨兴鑫 1,2,董金材 1,2,胡海波 3,王鑫 4,毕倩 1,2,李凤娇 1,2,

魏佳迪 1,2,梁丽 1,2,王曦 1,2,顾雯 1,2,俞捷 1,2

1.云南中医学院中药学院,云南 昆明 650500;2.昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室,云南 昆明 650500;

3.赣南医学院药学院,江西 赣州 341000;4.北京出入境检验检疫局,北京 100026

摘要:目的 比较研究《中华人民共和国药典》规定的3种基源黄精的化学成分差异。方法 利用超声法提取收集到的 17 批黄精药材,提取液经 PS/AL 固相萃取小柱净化后,采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Orbitrap MS)技术分别对其化学成分进行表征,并用多元统计分析处理数据,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交校正的偏最小二乘分析(OPLS-DA)及聚类分析(HCA)。结果 从正、负离子模式下的 PCA、PLS-DA、OPLS-DA 散点图及 HCA 树状图可见,3 种法定基源黄精明显聚为3类。结论 3种基源黄精的化学成分存在明显差异,所建立的分析方法可用于区分3种法定基源黄精。本研究结果可为黄精药材的深入研究及质量标准的制定提供依据。关键词:黄精;多花黄精;滇黄精;化学成分;超高效液相色谱-质谱联用;比较研究;多元统计分析

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.016

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0071-06

Comparative Study on Chemical Constituents in Three Official Materials of Polygonati Rhizoma by Using Multivariate Statistical Analysis

YANG Xing-xin1,2, DONG Jin-cai1,2, HU Hai-bo3, WANG Xin4, BI Qian1,2, LI Feng-jiao1,2,

WEI Jia-di1,2, LIANG Li1,2, WANG Xi1,2, GU Wen1,2, YU Jie1,2

1. College of Pharmaceutical Science, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China;

2. Kunming Key Laboratory for Metabolic Diseases Prevention and Treatment by Chinese Medicine, Kunming

650500, China; 3. College of Pharmaceutical Science, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China;

4. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China

Abstract: Objective To comparatively study the chemical constituents of the three official materials of Polygonati Rhizoma recorded in the Chinese Pharmacopoeia. Methods The 17 batches of medicinal materials were extracted by ultrasonic method. The extracts were purified by PS/AL column of solid phase extraction, and then analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem electrostatic field orbital trap high-resolution mass spectrometry (UPLC-Orbitrap MS) to profile their chemical constituents. After that, the obtained data were treated by using multivariate statistical analysis, including principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) and hierarchical cluster analysis (HCA). Results Three official materials of Polygonati Rhizoma clearly clustered as three classes, which were showed in the PCA, PLS-DA and OPLS-DA scatter plots and HCA dendrogram under both positive and negative ion mode. Conclusion There is significant discrepancy in the chemical constituents of the three official materials of Polygonati Rhizoma, and the analytical methods can be used to distinguish the three official medicinal materials. The results will provide basis for the further investigation and scientific development of quality standards of Polygonati Rhizoma.

基金项目:国家自然科学基金(81660596、81460623、81760733);云南省应用基础研究计划项目[2017FF117-(013)、2016FD050、

2014FA035、2014FZ083];云南省中青年学术和技术带头人后备人才(2015HB053);云南省高校南药研究协同创新中心(30270100500)通讯作者:俞捷,E-mail:cz.yujie@gmail.com

Keywords: Polygonati Rhizoma; Polygonatum cyrtonema Hua; Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl; chemical constituents; ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry; comparative study; multivariate statistical analysis

黄精具补肾益精、滋阴润燥之功,用于滋补强身

和治疗肾虚精亏、肺虚燥咳以及脾胃虚弱之证[1],是中医临床常用药物之一。现代药理研究表明,黄精具有增强免疫、降低血脂、血糖、延缓衰老等多种药理

作用[2],是重要的药食两用资源。

2015年版《中华人民共和国药典》规定,黄精来源于百合科植物滇黄精 Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黄精 Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精 Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。根据形状

[1]不同,分别习称“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精” 。

3 种法定基源黄精在我国分布较广,蕴藏量较大。其中,黄精分布于东北、华北、西北、华东以及河南、湖北、四川、贵州;多花黄精分布于华东、中南及四川、贵州等地;滇黄精主产云南,四川、贵州、广西

等省区也有分布[3-4]。黄精主要含有多糖、甾体皂苷、三萜皂苷、黄酮、

蒽醌、生物碱、木脂素、氨基酸等成分[5],其中甾体皂苷、三萜皂苷、黄酮为黄精属植物的特征性成分,甾体皂苷和多糖在黄精中含量较高且通常认为是其主要活性成分。尽管目前已建立了黄精这一植物品种的 HPLC 指纹图谱[6]及浙江产黄精药材酸水解物的HPLC 指纹图谱[7],且有报道不同产地的黄精植物中

薯蓣皂苷元含量差异较大[6],然而,《中华人民共和国药典》收载的3种法定基源黄精的化学成分是否存在差异尚未见报道。另外,在药材市场上,市售黄精类药材多为片状,难以采用性状鉴别、显微等方法区分、鉴定不同品种药材。为此,本研究采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱( UPLCOrbitrap MS)技术对收集的17批次不同基源黄精药材的化学成分进行表征分析,并利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交校正的偏最小二乘分析( OPLS-DA )及聚类分析

(HCA)4种多元统计分析方法对数据进行比较分析,探讨不同基源黄精化学成分的差异性,为黄精药材质量标准的制定提供依据,并为进一步的药效评价、资源开发利用奠定基础。

1 仪器与试药

Ultimate 3000超高效液相色谱串联Q Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技公司,美国),配有 CBM-20A 系统控制器、LC-20AD

四元泵、SIL-20A 自动进样器、CTO-20A 柱温箱及

SPD-M20A PDA 检测器;14-1275 超声波清洗机(宁

波新芝生物科技股份有限公司);DK-S24电热恒温水

浴锅(上海精宏实验设备有限公司);N-11000-WD 旋转蒸发器(上海爱朗仪器有限公司);万分之一电子分析天平(德国 Sartorius 公司);HR/16M 高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);MILLI-Q 超纯水系统(美国 Millipore 公司)。

PS/AL 固相萃取小柱(天津博纳艾杰尔科技公司);色谱级乙腈、色谱级甲醇(德国 Merk 公司);超纯水由 MILLI-Q 超纯水系统制备;其余试剂均为分析纯。

17批黄精药材(见表1),其中 1~8批经云南中医学院俞捷副教授鉴定为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.,9~11 批与

12~17 批经赣南医学院胡海波老师鉴定分别为百合科黄精属植物多花黄精 Polygonatum cyrtonema Hua.和百合科黄精属植物黄精 Polygonatum sibiricum Red.,凭证标本均保存于昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室。

2 方法

2.1供试品溶液的制备将黄精药材放入 50 ℃烘箱烘干至恒重,粉碎,过 40目筛。精密称取粉末5 g置锥形瓶中,加入70%乙醇 40 mL,摇匀,超声提取(500 W,40 kHz)30 min,放冷,抽滤,收集滤液,滤渣及滤纸一并转移至锥形瓶中,加70%乙醇 40 mL,超声 30 min 提取第2 次,放冷,抽滤,收集滤液,合并2次滤液,减压回收溶

剂(50 ℃),浸膏用70%甲醇 5 mL复溶。取 PS/AL固相萃取小柱,用20 mL 甲醇活化,20 mL水洗涤,再将5 mL样品溶液倒入固相萃取小柱中,用20 mL纯

水淋洗,25 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,减压回收溶

剂(50 ℃),用70%甲醇复溶并定容至5 mL。0.22 µm

滤膜过滤后得供试品溶液,4 ℃冰箱保存备用。

2.2 分析条件

2.2.1 超高液相色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,

5 µm);流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0 min,

10%A;20 min,25%A;30 min,35%A;40 min,50%A;

50 min,65%A;60 min,85%A;70 min,100%A;

75 min,100%A);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;

进样体积:10 µL。

2.2.2 质谱条件

采用全扫描(Full Mass)和数据相关二级质谱

(DD-MS2)模式检测。离子源为 ESI;毛细管温度

320 ℃;喷雾气流速 1.5 L/min;加热模块 250 ℃;全扫描正、负离子同时检测,分辨率70 000;接口电压

(+)3.5 kV,(-)2.8 kV;质量范围 m/z:100~1000 Da;

最长注入时间:200 ms。二级质谱正、负离子同时检测,数据相关二级质谱对最高的5个峰进行二级质谱裂解,分辨率17 500;质量范围 m/z:50~1000 Da;

最长注入时间:50 ms;CID 能量:30%;使用动态排除,动态排除时间10 s。工作站:Xcalibar 3.0.63,用于 LC/MS数据处理、分子式预测和精确分子量计算。

2.3 数据统计分析

原始数据先导入 XCMS-online 软件处理转换为Excel 格式,再将 Excel 表中数据导入 Simca 14.1 软件进行多元统计分析(HCA、PCA、PLS-DA、OPLS-DA)。3 结果与分析

3.1 液相色谱-质谱分析黄精药材中含有较多量的多糖、鞣质等水溶性成

分[5],会严重降低药材中甾体皂苷、三萜皂苷及黄酮等特征成分的检测灵敏度及分离度。目前已有研究采用液-液萃取法(正丁醇为萃取剂)净化黄精样品以 建立其 HPLC指纹图谱,对黄精皂苷类等成分进行了

较好分离和检测[6]。与液-液萃取法相比,固相萃取法具有回收率高、分离速度快、不产生乳化、溶剂用量

少等特点[8],而大孔吸附树脂常用于去除中药中的多糖、鞣质等水溶性成分。因此,本研究采用以大孔吸附树脂为主要填料的 PS/AL 固相萃取小柱对黄精药材提取液进行净化处理,除去样品中强极性水溶性成分后,再采用 LC/MS 对其中的皂苷、黄酮等特征成分进行表征,结果见图1。

从图1 中可以看出,17批黄精样品中的大量成分已被表征出来,且主要色谱峰均得到较好分离。通过对比发现,不同产地的同基源黄精的化学成分仍存在

差异:1~8批滇黄精中,样品2与其余7批样品差异

较大;9~11批多花黄精中,样品9与样品 10 和样品

11 差异较大;12~17 批黄精的区别亦较大。推测其原因可能是:这些样品生长在不同地区(环境),其生长条件、种植方式或/和管理方式不同,致使这些同基源样品的化学成分存在明显差异;另外,一些采自同一行政区的同基源黄精样品(如 1~3 批均采自云

南省文山市平坝镇,7、8批均采自云南省文山市大坪镇)的成分也存在一定差异,这可能是不同种植和管理方式导致的。这些结果充分体现了不同产地的同一品种药材的化学成分可能存在明显差异,在开展中药指纹图谱建立、中药制剂及临床应用等工作中应给予充分考虑。值得注意的是,不同基源黄精的化学成分差异更明显,为了更好地比较3种基源黄精化学成分的差异,本研究对获取的 LC/MS 数据进行多元统计分析。

3.2 多元统计分析

3.2.1 主成分分析

目前 PCA 已普遍被用于中药质量标准研究数据

的统计分析中[9],通过对数据降维、变量提取与压缩,确定中药资源的分类和聚类,并从中获取能用于区

分、鉴别等有用信息。17 批黄精样品的 PCA 结果见表2、图 2。 从图2中可以看出,除2批黄精品种(样品12、15)与滇黄精品种有交叉外,其余 15 批黄精药材明

显聚为3 类:1~8批滇黄精聚为一类,9~11批多花黄精聚为一类,13~17批黄精(除样品 15 外)聚为一类。结果表明,多花黄精、滇黄精和黄精的化学成分存在差异。

3.2.2 偏最小二乘判别分析

PLS-DA 为多变量数据分析技术中的判别分析法,基本思想是根据已知样品集特征,选定适合的判别准则,建立定性分析模型,最后用于判定未知样品。

17 批黄精样品 PLS-DA 结果见图 3,其中+p 的 R2X为 0.476,R2Y 为 0.999;-p 的 R2X 为 0.409,R2Y 为

0.999。17 批黄精样品明显聚成3 类:1~8批滇黄精

聚为一类,9~11 批多花黄精聚为一类,12~17批黄精聚为一类。结果表明,滇黄精、多花黄精和黄精的化学成分存在明显差异。

3.2.3 正交校正的偏最小二乘分析

OPLS-DA 是一种多因变量对多自变量的回归建模方法,其最大特点是可以去除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异,使分类信息主要集中在1个主成分中,模型变得简单和易于解释,其判别效果及主

成分得分图的可视化效果更加明显[10]。17 批黄精样品 OPLS-DA 结果见图 4,其中+p 的 R2X 为 0.673,

R2Y 为 1;-p 的 R2X 为 0.585,R2Y 为 1。17 批黄精

样品明显聚成 3 类:1~8 批滇黄精聚为一类,9~ 11 批多花黄精聚为一类,12~17批黄精聚为一类。表明滇黄精、多花黄精和黄精的化学成分存在明显差异。

3.2.4聚类分析

HCA 是根据研究对象特征对研究对象进行分类的一种方法,把性质相近的个体归为一类,使同一类中的个体都具有高度的同质性,不同类之间的个体具

有高度的异质性[11]。本研究分别在 PCA、PLS-DA、OPLS-DA 模式下进行HCA分析,结果见图5~图7。在HCA 图中,3种基源黄精均明显聚为3类(除图5A中黄精样品12、15与滇黄精样品聚为1 类外)。

尽管不同产地的同基源黄精的化学成分存在明显差异,但3种不同基源黄精样品却明显聚为3类,且 4 种统计方法(PCA、PLS-DA、OPLS-DA、HCA)的分析结果一致,充分说明3种法定基源黄精药材(多花黄精、滇黄精、黄精)的化学成分存在明显差异,其药理作用是否存在差异值得深入研究。此外,分析结果也表明,本研究所建立的PS/AL固相萃取-LC/MS分析方法可用于快速、有效区分3种法定基源黄精,在同基源黄精的化学成分有明显差异的情况下亦可用于区分不同基源。

小结本研究采用超声法提取17批不同基源黄精药材,提取液经 PS/AL固相萃取小柱净化,除去大部分水溶性成分后,采用 LC/MS 表征分析样品的化学成分,并利用 PCA、PLS-DA、OPLS-DA、HCA 对数据进行 统计分析。结果表明,3 种法定基源黄精药材的化学成分存在明显差异,且所建立的方法可用于区分3种法定基源黄精。研究结果可为黄精药材基源鉴定及质量标准制定提供依据,并为深入比较不同基源黄精的药理作用及黄精药材资源的开发利用奠定基础。

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(收稿日期:2017-10-17)

(修回日期:2017-11-05;编辑:陈静) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

图8 TBⅡ代谢途径

B 注:A.正离子模式;B.负离子模式;Ⅰ.多花黄精;Ⅱ.滇黄精;Ⅲ.黄精图 2 17批黄精样品PCA散点图

A

注:A.正离子模式;B.负离子模式;Ⅰ.多花黄精;Ⅱ.滇黄精;Ⅲ.黄精图 4 17批黄精样品 OPLS-DA 散点图

注:A.正离子模式;B.负离子模式;Ⅰ.多花黄精;Ⅱ.滇黄精;Ⅲ.黄精图 3 17批黄精样品 PLS-DA 散点图

注:A.正离子模式;B.负离子模式图 6 PLS-DA 模式下的HCA树状图

注:A.正离子模式;B.负离子模式图 5 PCA模式下的HCA树状图

注:A.正离子模式;B.负离子模式

图 7 OPLS-DA 模式下的HCA树状图

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