醒脑静注射液对β淀粉样蛋白 25-35诱导的 SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响

王茹 1，2，李卫萍 1，陈向荣1，张磊1，申艳方1，杜菊梅 1

1.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046摘要：目的 观察醒脑静注射液对β-淀粉样蛋白 25-35（Aβ25-35）诱导的 SH-SY5Y 细胞氧化损伤的影响，探讨其相关作用机制。方法 用不同浓度醒脑静（5、10、20 μL/mL）预处理 SH-SY5Y 细胞3h，随后以 25 μmol/L

Aβ25-35 处理 SH-SY5Y 细胞 24 h制备阿尔茨海默病体外模型。实验细胞分为正常对照组、模型组和醒脑静低、中、高剂量组，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）含量，酶标法检测细胞内丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平。结果 与正常对照组比较，模型组中细胞内 ROS 含量明显增加，MDA 水平明显升高，GSH、SOD 水平明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，不同浓度醒脑静预处理组细胞凋亡率降低，细胞内ROS含量明显降低，MDA水平明显下降， GSH、SOD 水平显著升高（P＜0.05）。结论 醒脑静注射液预处理可抑制Aβ诱导的细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，发挥细胞保护作用。

关键词：醒脑静注射液；细胞氧化损伤；细胞凋亡；β-淀粉样蛋白25-35；阿尔茨海默病

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0034-04

Effects of Xingnaojing Injection on Oxidative Damage Induced by Aβ25-35 in SH-SY5Y Cells

WANG Ru1,2, LI Wei-ping1, CHEN Xiang-rong1, ZHANG Lei1, SHEN Yan-fang1, DU Ju-mei1

1. The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China;

2. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

Abstract: Objective To investigate the effects of Xingnaojing Injection on oxidative damage induced by β-amyloid protein 25-35 (Aβ25-35) in SH-SY5Y cells; To discuss its mechanism of action. Methods SH-SY5Y cells with different concentrations of Xingnaojing injection (5, 10, 20 μL/mL) were pretreated for 3 hours, and then the external model of alzheimer's disease was established by treating SH-SY5Y cells with 25 μmol/L Aβ 25-35 for 24 hours. The experimental cell were randomly divided into normal control group, model group, and Xingnaojing low-, medium-, and high-dose groups. The apoptotic rate was measured by flow cytometry and intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA fluorescent probe. The expressionsof MDA, GSH and SOD in the cells were measured by enzyme standard instrument. Results Compared with the normal control group, the apoptotic rate of the model group was significantly increased; the content of ROS increased and the MDA level increased (P<0.05); GSH and SOD were significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the apoptotic rate of the pretreatment group was significantly lower than that of the model group; the content of ROS decreased and the MDA level decreased (P<0.05); GSH and SOD were significantly increased (P<0.05). Conclusion Xingjingjing Injection pretreatment can inhibit the cell oxidative damage and the cell apoptosis induced by Aβ25-35, which can play a cytoprotective effect.

Keywords: Xingnaojing Injection; cell oxidative damage; cell apoptosis; Aβ25-35; Alzheimer disease

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年人多发的神经退行性疾病，主要表现为进行性记忆和认知功能减退，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在脑组织异常沉积形成的老年斑和Tau蛋白异常磷酸化形成的神经纤维缠结是 AD 主要病理特征[1]。目前AD 发病机制尚不清楚，氧化应激学说在 AD 发病机制中扮演重要角色，抑制 Aβ 诱导的神经元氧化损伤对减轻AD病理损害、延缓病程进展具有重要意义[2]。

醒脑静注射液源自传统名方安宫牛黄丸，主要成分为麝香、郁金、冰片、栀子，有吸收快、易通过血脑屏障、在脑内具有较高浓度且停留时间长的药代动力学特点，已被证明对缺血性脑卒中、脑出血和蛛网膜下腔出血等神经系统疾病具有良好的临床疗效及

安全性[3]。醒脑静注射液对 AD患者亦有较好的疗效，可显著改善 AD 患者认知功能[4]，提高大鼠学习记忆

能力[5]，但其基础研究欠缺，具体分子作用机制尚不明确。本实验采用 Aβ25-35 诱导的 SH-SY5Y 细胞制备 AD细胞模型，观察醒脑静注射液预处理对Aβ 诱导的细胞氧化损伤的影响，探讨其相关作用机制。1 材料和方法

1.1 细胞

SH-SY5Y 细胞，中国科学院上海细胞库，培养于 10%胎牛血清和含“二抗”（100 U／mL青霉素、链霉素）的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内，当贴壁细胞覆盖瓶底达70%～80%时，按

1∶3进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2 药物醒脑静注射液，无锡济民可信山禾药业股份有限公司，批号 17031，规格 10 mL/支。

1.3 主要试剂和仪器

高糖DMEM培养基（美国 Gibco 公司），胎牛血清（美国 Hyclone 公司），Aβ25-35（美国 Sigma 公司）， Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），活性氧（ROS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南

京建成生物工程研究所）。CO2 恒温培养箱（美国Thermo 公司，BB15），荧光倒置显微镜（日本 Nikon公司），酶标仪（德国BMG公司），倒置相差显微镜（日本 Olympus 公司），流式细胞仪（美国 Beckman Coulter 公司），高速离心机（美国 Sigma 公司）。

1.4 分组及处理

培养的 SH-SY5Y 细胞随机分为 5 组。正常对照组：细胞正常培养27 h；模型组：细胞正常培养3 h， 随后用老化的 Aβ25-35（25 μmol/L）处理 24 h；醒脑

静低剂量组：醒脑静注射液（5 μL/mL）预处理细胞

3 h，随后用老化的 Aβ25-35（25 μmol/L）处理 24 h；

醒脑静中剂量组：醒脑静注射液（10 μL/mL）预处理细胞 3 h，随后用老化的 Aβ25-35（25 μmol/L）处理

24 h；醒脑静高剂量组：醒脑静注射液（20 μL/mL）预处理细胞3 h，随后用老化的 Aβ25-35（25 μmol/L）处理 24 h。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期 SH-SY5Y 细胞接种于 6 孔板，按上述方法进行分组处理，吸弃培养基，PBS洗涤细胞

1次，用不含EDTA 的 0.25%胰酶消化 1 min，终止消化后离心、收集细胞，取 5×105重悬细胞，1000 r/min离心 5 min，弃上清液，加 195 μL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，依次加5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，避光室温孵育15 min，立即用流式细胞仪上机检测。

1.6 DCFH-DA荧光探针检测活性氧含量将胰酶消化后的 SH-SY5Y 细胞进行计数，在 6孔板培养板中放入灭菌后的玻璃爬片，每孔滴入等量细胞悬液（每孔2 mL，细胞密度为 1×105个/mL），置于 37 ℃、5%CO2恒温培养箱孵育24 h，按照实验分组设计进行处理，随后弃去孔内液体，PBS重复清洗 1～2次，再用4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min， PBS 反复冲洗3次，每次静置5 min，随后加入浓度为 10 μmol/L DCFH-DA 工作液1 mL，37 ℃培养箱中孵育 30 min，弃孔内液体，加 PBS 反复洗涤1～2 次，加入抗荧光淬灭剂后甘油封片，移至荧光显微镜下进行观察。

1.7 丙二醛、还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平测定

收集处理后的各组细胞，分别采用硫代巴比妥酸法、微量酶标法和黄嘌呤氧化酶法测定细胞裂解液中MDA、GSH 含量和 SOD活性，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.8 统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方

—

差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 醒脑静注射液对 β-淀粉样蛋白 25-35 诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡的影响

Aβ25-35 处理 SH-SY5Y 细胞 24 h后细胞凋亡率升至 48.1%，高于正常对照组（4.3%）；醒脑静注射

液预处理后，醒脑静低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为 8.1%、10.3%和 30.7%，均低于模型组，见图 1。2.2 醒脑静注射液对 β-淀粉样蛋白诱导的 SH-SY5Y细胞内活性氧的影响

正常对照组细胞荧光强度较低，阳性细胞数较少，经 Aβ25-35 处理 SH-SY5Y 细胞 24 h后荧光强度较正常对照组增强，阳性细胞数增多，ROS生成增加；与模型组比较，醒脑静各剂量组细胞荧光强度降低，阳性细胞数减少，细胞内ROS生成减少。见图2。 讨论中医学认为，神明失用是AD发病的机制，心肾虚衰、痰瘀阻滞是导致神明失用的内在机制，当以开窍醒神、强记益智为施治总则。醒脑静注射液有醒脑开窍、行痰通瘀、清解毒邪之功效。现代研究显示，醒脑静注射液可明显缩短AD模型大鼠水迷宫实验逃避潜伏期，增加跨越原平台次数，减轻AD模型大鼠

学习记忆障碍[5]，改善 AD 患者简易智力状态检查量

表、老年痴呆量表-认知、全面衰退量表评分[4]。在缺血性卒中实验中，醒脑静注射液可明显减轻

脑缺血再灌注导致的小鼠记忆功能障碍[6]，提高脑梗死后脑组织 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶水平，降低MDA 水平，减轻脑缺血神经损伤[7]。刘洋等[8]研究发

2.3 醒脑静注射液对 β-淀粉样蛋白 25-35 诱导的

SH-SY5Y 细胞丙二醛、还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平的影响

与正常对照组比较，模型组细胞内MDA水平明显升高，GSH 和 SOD水平明显降低，差异有统计学

意义（P＜0.05）；与模型组比较，醒脑静低、中、高剂量组 MDA 水平明显降低，GSH 和 SOD 水平明显

升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且醒脑静低剂量组作用更明显。见表1。 现，醒脑静固体制剂可降低缺血性脑损伤恢复早期大鼠神经功能缺损评分，提高横木行走能力评分和前肢抓握力，同时显著降低缺血侧脑组织MDA含量，提示醒脑静可能通过减轻氧化损伤发挥神经保护作用。多项研究表明，醒脑静注射液在缺血再灌注模型中具

有显著自由基清除作用，是一种有效的抗氧化剂[9]，但对AD模型是否同样有效却缺乏基础研究。本实验采用AD 细胞模型研究表明，Aβ25-35 干预 SH-SY5Y细胞 24 h可诱发细胞氧化损伤，促进细胞凋亡。细胞外Aβ异常沉积可通过直接或间接诱导细胞内ROS产生攻击细胞生物膜、抑制线粒体呼吸链复合酶活性、

激活氧化应激级联反应等[10-11]，导致细胞发生氧化应激，造成细胞结构及功能障碍，引起细胞凋亡，同时

氧化应激导致线粒体损伤后产生的大量 ROS 除进一步加重细胞氧化损伤外，还可促进 Aβ 生成、聚集，强化 Aβ 神经毒性作用，从而形成恶性循环[12-13]。目前尚缺乏治疗AD的特异性药物，抗氧化剂和自由基清除剂对改善AD患者认知功能、延缓病情进展可能具有一定作用。尚亚细亚等[14]发现醒脑静预处理可提高细胞内 ATP含量和线粒体膜电位水平，从而提高细胞存活率。本实验结果发现，不同浓度醒脑静注射液预处理可相对降低AD细胞凋亡率，减少脂质过氧化产物 MDA生成，同时提高 GSH-Px、SOD 水平，减少 ROS生成，且醒脑静低剂量组作用更明显。

综上，本实验采用AD细胞模型研究发现，醒脑静注射液通过清除自由基、增强细胞内抗氧化酶活性，抑制 Aβ 诱导细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，发挥神经保护作用。

参考文献：

[1] GOEDERT M. Alzheimer’s and Parkinson’s diseases ： The prion concept in relation to assembled Aβ, tau, and α-synuclein[J].

Science,2015,349(6248)：1255555.

[2] 董贤慧,柴锡庆.阿尔茨海默病发病机制研究进展[J].中国老年学杂

志,2014,34(20)：390-394.

[3] PENG W, YANG J, WANG Y, et al. Systematic review and Meta-analysis of randomized controlled trials of Xingnaojing treatment for stroke[J]. Evidence-Based Complementray and Alternative Medicine,2014,2014：210851.

[4] 李明秋,黄海华,张国胜,等.醒脑静注射液治疗阿尔茨海默病的临床

疗效观察[J].中国中西医结合急救杂志,2011,18(5)：309-311.

[5] 李雷.醒脑静注射液对AD大鼠脑部的 NOS_1 阳性神经元和 APPmRNA 的

影响[D].重庆：重庆医科大学,2007.

[6] 周红宇,胡国新,陈醒言,等.醒脑静注射液对脑缺血再灌注小鼠记忆

功能的保护作用[J].温州医学院学报,2002,32(3)：140-141,143.

[7] 马斌,刘璐,张扬,等.醒脑静注射液对高血压脑梗死大鼠模型的神经

保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(2)：212-214.

[8] 刘洋,孙建宁,董世芬,等.醒脑静固体制剂对缺血性脑损伤大鼠恢复

早期的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(16)：175-180.

[9] 李江茹,潘陈为,林巍,等.醒脑静注射液在神经细胞凋亡中作用的研

究进展[J].实用医学杂志,2013,29(2)：171-173.

[10] 张倩,李建涛,宋春霞,等.阿尔茨海默病治疗药物研究进展[J].中国

老年学杂志,2015,35(8)：2282-2285.

[11] BUTTTERFIELD D A, DRAKE J, POCERNICH C, et al. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain：central role for amyloid beta-peptide[J]. Trends Mol Med,2001,7(12)：548.

[12] LUSTBADER J W, CIRRILLI M, LIN C, et al. ABAD directly links Aβ to mitochondrial toxicity in Alzheimer's disease[J]. Science,

2004,304(5669)：448.

[13] 刘芳,王春梅.阿尔茨海默病中的氧化应激及抗氧化治疗[J].暨南大

学学报(自然科学与医学版),2015,36(5)：406-409.

[14] 尚亚细亚,杜菊梅,张磊,等.醒脑静对Aβ25-35 诱导的 SH-SY5Y 细胞

线粒体损伤的保护作用[J].卒中与神经疾病,2017,24(4)：297-301.

（收稿日期：2018-01-24）

（修回日期：2018-02-01；编辑：华强）