电针对脾虚大鼠胃动力及丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响

李慧艳，张超，徐灏，刘洁，李菲，杨琦西安市第三医院消化内科，陕西 西安 710021

摘要：目的 探讨电针对脾虚大鼠胃动力的调节作用及其相关机制。方法 SD大鼠皮下注射利血平造成实验性脾虚模型，实验分为正常组、模型组、针刺组、非穴组，电针“足三里”干预7d，观察大鼠胃电参数变化，检测胃排空率及肠推进率，血清胃泌素及胃动素水平，胃窦组织缝隙连接蛋白43（CX43）、p-细胞外信

号调节激酶（ERK）1/2、p-c-Jun 氨基末端激酶（p-JNK）、p-p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠胃运动频率及幅度显著降低，胃排空率、血清胃泌素及胃动素水平降低，胃窦组织 CX43蛋白表达明显下调；与模型组、非穴组比较，电针组大鼠胃运动频率及幅度显著升高，胃排空率及血清胃泌素、胃动素水平升高，胃窦组织 CX43、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达明显上调。结论 电针“足三里”可促进脾虚大鼠胃动力，其作用机制可能与胃窦组织CX43的高表达和MAPK信号转导通路ERK1/2及 p38 MAPK磷酸化有关。

关键词：电针；足三里；胃动力；缝隙连接蛋白43；丝裂原活化蛋白激酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.011

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0044-04

Effects of Electroacupuncture on Gastric Motility and MAPK Signal Transduction Pathways in Rats with Experimental Spleen Deficiency

LI Hui-yan, ZHANG Chao, XU Hao, LIU Jie, LI Fei, YANG Qi

Division of Gastroenterology, Xi’an Third Hospital, Xi’an 710021, China

Abstract: Objective To investigate the regulative effects of electroacupuncture on gastric motility in rats with experimental spleen deficiency; To explore its possible mechanism. Methods Rat model of experimental spleen deficiency was established by subcutaneous injection of reserpine, and were randomly divided into control group, model group, acupuncture group, and non-acupoint group. After electroacupuncture stimulation at “Zusanli” for 7 days, the changes of gastric electrical activity, the gastric emptying and intestinal propulsion rate, the serum levels of gastrin and motilin, and the protein expressions of CX43 in gastric antrum were determined. Results Compared with control group, the frequency and amplitude of gastric motility, gastric emptying rate, the serum levels of gastrin and motilin, and the expressions of CX43 decreased in the model group. Compared with model group and non-acupoint group, the frequency and amplitude of gastric motility, gastric emptying rate, the serum levels of gastrin and motilin, and the expressions of CX43, p-ERK1/2, and p-p38 MAPK increased in the electroacupuncture group. Conclusion Electroacupuncture stimulation at “Zusanli” acupoint can promote gastric motility in rats with experimental spleen deficiency, and this effect may be attributed to the high expression of CX43, as well as ERK1/2 and p38 MAPK phosphorylation in gastric antrum.

Keywords: electroacupuncture; Zusanli acupoint; gastric motility; CX43; MAPK; rats 有研究表明，针灸可被广泛的应用于治疗多种功能性胃肠疾病[1-2]。针刺不同穴位可通过调节胃酸分 泌、协调胃及不同肠段的运动，从而改善机体的胃肠

功能状态[3]。其中足三里乃胃之合穴，是临床上治疗胃肠疾病使用频次最高的穴位之一，对改善胃肠功能、消除胃肠功能失常所产生的病理症状有较好疗

效[4]。课题组前期研究发现，针刺“足三里”可显著

激活健康大鼠胃电起搏区卡哈尔间质细胞（interstitial cells of cajal，ICCs）及与 ICCs信息传递密切相关的缝隙连接蛋白 43（connexin 43，CX43）的表达，并进一步促进细胞信号转导通路丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族中细胞外信号调节激酶（ extracellular signal related kinases，ERK）的表达[5]，但其对脾虚大鼠胃动力的调节作用及潜在的机制尚不明确。故本研究以利血平所致脾虚证模型大鼠为研究对象，探讨针刺“足三里”对脾虚大鼠胃运动的调节作用及可能的分子机制。1 实验材料

1.1 动物

成年雄性SD 大鼠 60只，清洁级，体质量200～

250 g，第四军医大学实验动物中心，动物许可证号

SCXK（军）2012-007。分笼饲养于 SPF 级动物实验室，光照 12 h明暗交替，温度（22±1）℃、相对湿

度（55±5）%，自由摄食饮水。

1.2 药物

利血平注射液，批号160501，上海复旦复华药业有限公司。

1.3 主要试剂与仪器

胃泌素、胃动素 ELISA 检测试剂盒，上海西唐生物科技有限公司；兔抗大鼠 CX43、ERK1/2、

p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、β-actin 抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，英国 Abcam 公司。LH202H韩氏电针仪（北京华卫产业

开发公司），华佗牌一次性针灸针（0.25 mm×13 mm，

苏州医疗用品厂有限公司），5417 型低温高速离心机（美国 Eppendorf 公司），Biopac 多导生理记录仪（美国 Biopac 公司），MULTISKAN GO全波长酶标仪（美国 Thermo 公司），POWERPAC BASIC 蛋白电泳系统（美国 BIO-RAD 公司），ST-1 型动物恒温手术台（成都仪器厂）。

2 实验方法2.1 造模、分组及应力传感器埋置

参考文献[6]方法大鼠每日皮下注射利血平注射

液（0.01 mg/kg）建立脾虚模型。自由摄食饮水，5 d后出现体质量下降、食量减退、大便稀少、蜷缩、毛发蓬松无光泽、活动减少等，提示造模成功。大鼠适应性喂养7d后随机分为正常组、模型组、针刺组、非穴组，每组15只。腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）大鼠麻醉，固定后腹部备皮，常规消毒，开腹暴露胃体，距幽门 0.3 cm处沿环形肌方向将应力传感器缝贴

于胃窦腹侧面浆膜，导线经皮下引至颈部固定[7]。

2.2干预

[8]穴位选取参照《实验针灸学》 。“足三里”位于大鼠双后肢膝关节后外侧腓骨小头外下5 mm处。电针时将大鼠固定于特制的有机玻璃笼内，于“足三里”直刺 5 mm，电针参数为疏密波，频率 2/100 Hz，强度起始1 mA，10 min 后调为 1.5 mA，10 min 后再调为 2 mA，共30 min（每 10 min提插捻转1 次），1 次/d，连续 7 d。正常组和模型组大鼠每日同一时间固定

30 min，但不电针干预；非穴组选取大鼠双后肢“足三里”旁开5 mm处直刺5 mm，其余电针参数及干预方法同针刺组。

2.3 胃运动检测所有大鼠均在上述电针或非电针处理的第7日做胃电图。实验前12 h禁食不禁水。动物置于特制鼠笼内，将应力传感器导线接于 Biopac 多导生理记录仪，通过生物信号记录系统记录胃运动（量程 1 mV，滤波 20 Hz）。采用 Acqknowledge 软件分析，取胃运动幅度的平均值及频率为观察指标。

2.4 胃排空率及肠推进率检测胃运动记录结束后，各组随机取7只大鼠灌入半

固体营养糊，30 min后脱颈椎处死，剖开腹部，结扎胃贲门和幽门，取出胃并用滤纸擦拭干净后称量胃全重和胃净重。将幽门至直肠末端完整取出，不加牵引平铺开，测量肠全长和炭末推进长度。计算大鼠胃排空率和肠推进率。胃排空率（%）＝（胃全重－胃净

重）÷半固体营养糊质量×100%，肠推进率（%）＝

炭末推进长度÷肠全长×100%。

2.5 血清胃泌素及胃动素检测剩余大鼠胃运动记录结束后腹腔注射 10%水合

氯醛（3 mL/kg）麻醉，固定后解剖大鼠，腹主动脉取血，注入含 7.5%EDTA-2Na 和抑肽酶的试管中静止

30 min，4 ℃、3000 r/min 离心 10 min，取上清液，

-20 ℃冰箱保存待测。严格按胃泌素、胃动素ELISA检测试剂盒说明书操作。

2.6 胃窦组织相对蛋白表达检测脱颈处死大鼠，取大鼠胃窦组织剪碎，加蛋白裂解液，冰上高速分散器匀浆约1 min，4 ℃、5000 r/min离心 20 min，取上清液进行蛋白定量。蛋白变性后取等量蛋白经SDS-PAGF电泳分离，转移至PVDF膜上，

37 ℃脱脂奶粉封闭 30 min，加入 1∶1000 稀释的

CX43、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、

p-p38 MAPK、β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜，加 1∶5000

稀释的羊抗兔二抗，37 ℃孵育 30 min，ECL 发光显色，凝胶成像系统进行摄影分析。

3 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异

—

有统计学意义。

4 结果4.1 电针对脾虚大鼠胃运动的影响与正常组比较，模型组大鼠胃运动频率及幅度明

显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组、非穴组比较，

针刺组大鼠胃运动频率及幅度显著升高（P＜0.05）。结果见表1。

4.2 电针对脾虚大鼠胃排空率和肠推进率的影响与正常组比较，模型组大鼠胃排空率显著降低

（P＜0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组大鼠胃

排空率显著增加（P＜0.05）。各组大鼠肠推进率变化不明显。结果见表2。

4.3 电针对脾虚大鼠血清胃泌素及胃动素水平的影响与正常组比较，模型组大鼠血清胃泌素、胃动素

含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组大鼠血清胃泌素、胃动素

含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。 4.4 电针对脾虚大鼠胃窦组织CX43蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织CX43 蛋白

表达显著下降（P＜0.01）；与模型组、非穴组比较，针刺组大鼠胃窦组织 CX43 蛋白表达明显上调（P＜

0.05）。结果见表 4、图 1。

4.5 电针对脾虚大鼠胃窦组织细胞外信号调节激酶

1/2、p-c-Jun 氨基末端激酶、p-p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白表达的影响

与模型组比较，非穴组大鼠胃窦组织p-ERK1/2、

p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白表达无明显变化，差异无

统计学意义（P＞0.05）；与模型组、非穴组比较，针刺组大鼠胃窦组织ERK1/2 及 p38 MAPK磷酸化水平

显著上升（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表 5、图 2。

讨论胃肠运动功能障碍是许多胃肠道疾病及其他疾病的重要临床表现。有研究显示，针刺“足三里”对胃肠运动功能有良性的调节作用且以促进胃运动为

主[9]。本研究发现，电针“足三里”后可明显增加脾虚大鼠的胃运动频率及幅度，并高胃排空率，初步证明电针“足三里”可促进脾虚大鼠的胃动力。

胃肠激素对消化系统的生理功能具有重要的调节作用，目前研究认为胃泌素可通过迷走神经系统增强胃窦的运动，有利于胃排空；胃动素则可通过激发消化间期肌电活动Ⅲ相，促进胃平滑肌强力收缩。本实验发现，针刺组经电针干预1周后，脾虚大鼠胃肠激素水平发生明显变化，大鼠血清胃泌素及胃动素水平明显回升，而非穴组无明显改善。表明电针“足三里”促进脾虚大鼠胃动力作用可能与调节胃泌素及胃动素的分泌有关。

缝隙连接（gap junction，GJ）是正常细胞的连接方式之一，具有细胞间通讯功能，CX为 GJ的基本结构和功能单位，其中在机体内广泛分布的 CX43 是GJ 组成的主要连接蛋白。在胃肠道内，肠神经-ICC平滑肌通过大量 GJ 形成网络结构，并成为胃肠动力的基本功能单位，作为缝隙连接通讯重要构成成分的

CX43 对胃肠道动力的形成和调节起着关键性作用，电活动的传播会因CX43的缺失或减少而受到抑制，并且对平滑肌细胞的兴奋性具有抑制作用，从而对胃肠道的舒缩活动有一定影响。本研究发现，脾虚模型大鼠胃窦组织CX43表达显著降低，电针“足三里”可明显上调 CX43 的表达，提示 CX43 对于针刺“足三里”改善胃功能障碍性疾病可能有着重要的意义。

MAPK 级联信号通路广泛存在于各种哺乳动物细胞中的一条信号传导途径，能对多种细胞外刺激发生反应，是将细胞外信号进行整合处理并转导成为一种细胞反应的主要机制，参与细胞的生长、发育、分裂及细胞间功能同步等多种生理过程。课题组前期研究发现，电针“足三里”对胃动力的调节作用与MAPK

信号转导通路密切相关[10]。故本研究考察了针刺脾虚大鼠“足三里”后MAPK通路中3个重要亚族ERK1/2、JNK 及 p38 MAPK的磷酸化水平，发现经电针干预1周后，脾虚大鼠胃窦组织 ERK1/2 及 p38 MAPK 的磷 酸化水平显著上升，但 JNK 的磷酸化水平无明显上调，提示 MAPK通路中 ERK1/2 及 p38 MAPK 亚族可能参与针刺“足三里”促进脾虚大鼠胃动力作用的信号转导。

综上，本研究表明，针刺“足三里”可升高胃运动频率及幅度，提高胃排空率，改善脾虚大鼠胃动力，其作用机制可能与增加机体胃泌素及胃动素分泌，上调胃窦组织 CX43 表达，促进MAPK通路中 ERK1/2及 p38MAPK的磷酸化有关。但针刺机理较为复杂，其促进脾虚大鼠胃动力分子机制还有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-12-07）

（修回日期：2018-01-11；编辑：华强）