CJI (Traditional Chinese Medicine)
参元丹优化方对动脉粥样硬化小鼠胰岛素抵抗及血清血栓素A2/前列环素比值和DNA甲基化水平的影响
张颖，刘红旭，康群甫，任攀，刘卫红，周明学首都医科大学附属北京中医医院，北京市中医研究所，北京 100010
摘要：目的 观察参元丹优化方对高脂喂养 ApoE 基因敲除（ApoE-/-）小鼠动脉粥样硬化（AS）胰岛素抵抗及血清血栓素 A2（TXA2）/前列环素（PGI2）比值和 DNA甲基化（5-mC）水平的影响，探讨其相关作用机制。方法 40 只 8周龄雄性 ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养 6周，随机分为模型组、立普妥组、参元丹原方组和参元丹优化方组，各给药组给予相应药物干预6周。检测小鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度
脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、胰岛素、TXA2、PGI2、DNA 甲基化转移酶（DNMT1）和 5-mC 水平。HE 染色，图像分析测量小鼠主动脉 AS 斑块面积。结果 与模型组比较，参元丹原方组和参元丹优化方组小鼠血清TC 和 TG 水平明显降低，HDL-C 水平明显升高（P＜0.01），AS 指数明显降低，校正后主动脉AS斑块面积显著降低（P＜0.05），参元丹优化方组小鼠血清 5-mC、DNMT1、胰岛素水平及 TXA2/PGI2
比值显著降低（P＜0.05），参元丹优化方组优于参元丹原方组（P＜0.01）。结论 参元丹优化方降低血清胰岛
素、5-mC 水平和 TXA2/PGI2比值均优于原方，改善血脂和AS效果与原方相当。关键词：参元丹；动脉粥样硬化；胰岛素抵抗；血栓素A2/前列环素 I2；DNA 甲基化；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0053-05
Effects of Optimum Shenyuandan Decoction on Insulin Resistance, Serum TXA2/PGI2 Ratio and DNA Methylation Level of Mice with Atherosclerosis
ZHANG Ying, LIU Hong-xu, KANG Qun-fu, REN Pan, LIU Wei-hong, ZHOU Ming-xue
Beijing TCM Hospital Affiliated to Capital Medical University,
Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100010, China
Abstract: Objective To investigate the effects of optimum Shenyuandan Decoction on insulin resistance, serum TXA2/PGI2 ratio and 5-mC level of ApoE-/- mice with atherosclerosis (AS) fed with high fat diet; To discuss the related mechanism of action. Methods Totally forty 8 week-old male ApoE-/- mice were fed with high fat diet for 6 weeks. They were randomly divided into model group, Lipitor group, Shenyuandan Decoction group and optimum Shenyuandan Decoction group. Each group was given relevant medicine for intervention for 6 weeks. Serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, insulin, TXA2, PGI2, DNMT1 and 5-mC level were measured. HE staining and image analysis were used to measure the AS plaque area of the mouse aorta. Results Compared with the model group, the serum levels of TC and TG in Shenyuandan Decoction group and optimum Shenyuandan Decoction group decreased significantly, the level of HDL-C increased significantly (P<0.01); the AS index decreased significantly and the area of the AS plaque in the aorta decreased significantly (P<0.05). The serum levels of 5-mC, DNMT1, insulin and the ratio of TXA2/PGI2 in optimum Shenyuandan Decoction group decreased significantly (P<0.05), and optimum Shenyuandan Decoction group was better than Shenyuandan Decoction group (P<0.01). Conclusion Optimum Shenyuandan Decoction is superior to Shenyuandan Decoction in reducing the serum insulin, 5-mC level, and the ratio of TXA2/PGI2, and the effect is equivalent to Shenyuandan Decoction in improving blood lipid and AS.
Keywords: Shenyuandan Decoction; atherosclerosis; insulin resistance; TXA2/PGI2; DNA methyaltion; mice
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）患者常伴有
胰岛素抵抗和血小板聚集状态异常[1]。有研究表明， DNA 甲基化（5-mC）是导致 AS 和胰岛素抵抗发生
发展的重要机制[2]。参元丹胶囊是首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，既往研究发现，其治疗 AS
性心血管疾病疗效显著[3]，但其是否在抗 AS 的同时有干预胰岛素抵抗及抗血小板凝集的作用尚不清楚。为验证其上述作用，本实验以高脂喂养的ApoE 基因敲除（ApoE-/-）小鼠为观察对象，采用参元丹优化方进行干预，并与原方进行比较，观察参元丹优化方对高脂喂养 ApoE-/-小鼠 AS胰岛素抵抗及血清血栓素A2
（TXA2）/前列环素（PGI2）比值和 5-mC 水平的影响，探讨其相关作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物参元丹原方（黄芪、党参、玄参、丹参、延胡索、土鳖虫、水蛭、地龙等），参元丹优化方在原方基础上加瓜蒌、薤白，上述饮片由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。将饮片分别浸泡于不锈钢锅中，按 10 g/100 mL比例加自来水，浸泡 1 h，煎煮
2 次；将 2次药液混匀，浓缩，将浓缩液倒入 100 mL试剂瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用。阿托伐他汀钙片，上海辉瑞制药公司，批号R37964。
1.2 主要试剂与仪器血清胆固醇（TC）检测试剂盒（批号 110821）、三酰甘油（TG）检测试剂盒（批号110541）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒（批号 120531）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒（批号
120501），中生北控生物科技股份有限公司；血清DNA
甲基化转移酶（DNMT1）检测试剂盒，美国R&D 公司；小鼠血清胰岛素检测试剂盒，美国 R&D 公司，血清 PGI2检测试剂盒，美国 R&D 公司；血清 TXA2检测试剂盒，美国R&D公司。超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪（UPLC-Q-TOF–MS，日本岛
津公司，LC-20AT），全波长酶标仪（美国 Thermo 公
司，1500），光学显微镜（日本OLYNPUS 公司，CX31），组织脱水机（德国 LEICA 公司，TP1020），石蜡包埋机（德国 LEICA 公司，EG1140H）；石蜡切片机（德国 LEICA 公司，RM2130）。
1.3 动物、分组及给药
清洁级 ApoE-/-小鼠 40 只，8周龄，体质量18～
20 g，北京维通利华实验技术有限公司，动物许可证号 SCXK（京）2012-0001。高脂饲料（脂肪 21%、胆固醇 0.15%）喂养 6周后，所有成模小鼠随机分为
模型组、立普妥（3 mg/kg）组、参元丹原方（80 mg/kg）
组、参元丹优化方（10.72 mg/kg）组，每组 10 只。给药组根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，并按成人与小鼠的给药剂量换算系数折算成小鼠用量灌
胃给药[4]，模型组给予等量生理盐水。每日 1 次，每次 0.2 mL，连续 6 周。12周后，实验动物脱颈处死，眶下静脉丛取血，保留血清，无菌条件下摘取心脏，
4%多聚甲醛固定。动物实验处理均严格遵循动物福利原则及首都医科大学附属北京中医医院实验动物伦理委员会的要求。
1.4 血脂和胰岛素检测氧化酶法和直接法检测小鼠血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平，计算 AS 指数（AI）。AI＝ （TC－HDL-C）÷HDL-C，ELISA 检测小鼠血清胰岛素水平。严格按试剂盒说明书操作。
1.5 血栓素 A2和前列环素检测
ELISA 检测小鼠血清 TXA2、PGI2水平。严格按试剂盒说明书操作。
1.6 DNA甲基化转移酶和DNA甲基化水平检测ELISA 检测小鼠血清DNMT1 水平，HPLC 检测小鼠血清 5-mC水平。严格按试剂盒说明书操作。
1.7 病理观察
HE 染色和 IPP 图像软件分析测量小鼠主动脉管
腔面积（LA，mm2）、内弹力膜围绕面积（IELa，mm2），并计算小鼠斑块面积、校正后斑块面积。斑块面积（ PA ， mm2 ）＝ IELa － LA ；校正后斑块面积＝ PA/IELa。
1.8 统计学方法
采用 SPSS11.5 统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，组间比较用方差分析，两两比较用t 检验。—
P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果2.1 小鼠主动脉粥样硬化模型复制结果高脂喂养 12 周后，ApoE-/-小鼠主动脉管壁可见典型的富含胆固醇酯的AS斑块（见图1），斑块有成熟的纤维帽覆盖。说明复制AS模型成功。
2.2 参元丹优化方对模型小鼠血脂水平和动脉粥样硬化指数的影响
与模型组比较，各给药组小鼠血清 TC 和 TG 水
2.3 参元丹优化方对模型小鼠校正后主动脉斑块面积的影响
与模型组比较，各给药小鼠校正后主动脉AS 斑
块面积显著降低（P＜0.01），见图 2、图 3。 各组小鼠主动脉斑块形态观察（HE染色，×200） 平明显降低，小鼠血清 HDL-C 水平明显升高（P＜
0.01），见表 1。与模型组比较，各给药组小鼠 AI 显
著降低（P＜0.01），见表 2。
—
2.4 参元丹优化方对模型小鼠血清胰岛素水平的影响
与模型组比较，立普妥组和参元丹优化方组小鼠
血清胰岛素水平明显降低（P＜0.01）；与参元丹原方组比较，参元丹优化方组小鼠血清胰岛素水平明显降
低（P＜0.01）。见表 3。
2.5 参元丹优化方对模型小鼠血清血栓素 A2和前列环素水平的影响
与模型组比较，立普妥组和参元丹优化方组小鼠血清 TXA2水平显著降低，血清PGI2水平显著升高，
TXA2/PGI2 比值显著降低（P＜0.01）；与参元丹原方组比较，参元丹优化方组小鼠血清 TXA2/PGI2比值显
著降低（P＜0.01）。见表 4。
2.6 参元丹优化方对模型小鼠血清DNA甲基化转移酶和 DNA甲基化水平的影响
与模型组比较，各给药组小鼠血清 DNMT1 及
5-mC 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，
P＜0.01）；与参元丹原方组比较，参元丹优化方组小鼠血清 5-mC 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜
0.01）。见图 4、图 5。
3 讨论
胰岛素抵抗作为AS的独立危险因素，可引起脂质代谢异常和炎症反应，是多种代谢性异常疾病发病的中心环节。而临床上AS患者常伴有血小板聚集状态异常。既往研究表明，参元丹胶囊具有保护缺血心肌/抗心肌脂质过氧化、保护缺血再灌注损伤、防止心
肌细胞发生凋亡和自噬等药理作用[5-9]，但其是否在抗 AS的同时兼有干预胰岛素抵抗及抗血小板凝集的作用尚不清楚。本实验结果表明，参元丹优化方降低
血清胰岛素、5-mC 水平和 TXA2/PGI2比值均优于原方，改善血脂和AS效果与原方相当。
参元丹胶囊是根据冠心病心绞痛气虚血瘀证的临床特点，基于中医络病理论，以益气逐瘀法为组方原则的经验方。处方在重用黄芪、党参益气扶正的基础上，选用水蛭、土鳖虫破血逐瘀，并配以玄参、丹参、地龙、延胡索。方中水蛭、土鳖虫、地龙均为虫蚁之类，藉其“蠕动之物可以松透病根”而直入络分幽微之所，搜剔血络，透毒外出，则络脉瘀滞瘀毒可除；“邪之所凑，其气必虚”，故又兼顾其络脉空虚，以党参补中益气，黄芪扶助正气，玄参滋而不腻，充 养络脉，丹参养血活血，延胡索行气活血止痛，共奏益气逐瘀、行气通络之效。参元丹优化方在原方基础上加瓜蒌、薤白，其改善血脂和AS效果与原方相当。
胰岛素抵抗作为AS独立危险因素，是连接多种代谢性异常疾病的中心环节。我们既往研究发现，将黄芪、党参、丹参、土鳖虫、水蛭和延胡索进行配伍有抗 AS作用[3]，而添加瓜蒌、薤白这两味宽胸化痰、通阳散结的药物后，有改善胰岛素抵抗的作用。
TXA2 主要由血小板微粒体合成并释放，具有促进血小板聚集和诱导血栓形成的作用，是目前已知最
强的血小板聚集诱导剂和缩血管物质之一。PGI2主要由血管内皮细胞和平滑肌细胞产生，是血小板聚集最有效的内源性抑制剂，具有舒张血管和抗血小板聚集
的作用。TXA2与 PGI2之间的动态平衡可维持血管壁紧张度，共同参与冠脉张力，二者平衡失调，易导致
血小板聚集、血栓形成[10]。本研究结果显示，与模型组比较，立普妥组和参元丹优化方组小鼠血清 TXA2
水平显著降低，PGI2水平显著升高，TXA2/PGI2比值与参元丹原方相比显著降低。提示参元丹优化方在改善胰岛素抵抗发挥抗AS作用的同时还可能有预防血栓形成的作用，效果优于原方。
研究发现 5-mC 程度改变可导致胰岛素抵抗及
2 型糖尿病发生[11]。5-mC 水平是表观遗传学5-mC 标记物，在基因沉默和印记等生物学过程中至关重
要[12]。研究表明，AS 小鼠血管内皮被检出高水平的
5-mC，且高水平 5-mC 与血管细胞 LDL 受体和内皮
炎症相关[13]。DNMT1 是维持 5-mC最主要的催化酶。本研究结果提示，参元丹优化方和参元丹原方均可降低血清 5-mC 和 DNMT1水平，且优化方优于原方。说明方剂优化后改善胰岛素抵抗和 TXA2/PGI2 比值的机制可能与调整5-mC 水平有关。
综上，参元丹优化方在改善血脂和AS方面效果与原方相当，在降低血清胰岛素水平和 TXA2/PGI2 比值方面优于原方，其机制与改善5-mC 水平有关，其具体分子机制尚需深入研究。
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（收稿日期：2018-04-14）
（修回日期：2018-05-23；编辑：华强）