肾衰Ⅱ号方对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织NF-κB/TNF-α信号通路表达的影响

杨婧，祝婷婷，王琛上海中医药大学附属曙光医院肾病科，上海 201203

摘要：目的 观察肾衰Ⅱ号方对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织 NF-κB/TNF-α 信号通路表达的影响，探讨其改善慢性肾功能衰竭微炎症状态、延缓慢性肾脏病进展的作用机制。方法 采用 5/6（ablation/infarction，A/I）肾切除法制作慢性肾功能衰竭动物模型。实验大鼠随机分为模型组、西药对照组、肾衰Ⅱ号方组，每组14 只，另设假手术组14只，各给药组给予相应药物。测定大鼠血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、内生肌酐清除率（CCr），采用 Western blot 测定磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）p65、NF-κB p65、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白表达， RT-PCR 测定 TNF-α mRNA 表达。结果 与假手术组比较，模型组 SCr、BUN 水平明显升高，CCr 明显降低

（P＜0.01），左肾质量/体质量明显增加（P＜0.05），肾脏皮质、髓质 p-NF-κB p65、NF-κB p65 及 TNF-α 表达

均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，肾衰Ⅱ号方组、西药对照组 SCr、BUN 水平明显降低（P＜0.05，

P＜0.01），CCr 明显升高（P＜0.01），左肾质量/体质量明显降低（P＜0.05），肾衰Ⅱ号方组在改善肾功能方面

优于西药对照组（P＜0.05）；肾衰Ⅱ号方组、西药对照组肾脏皮质、髓质p-NF-κB p65、NF-κB p65 及 TNF-α

表达均明显降低（P＜0.01），肾衰Ⅱ号方组下调 NF-κB/TNF-α 信号通路表达作用优于西药对照组（P＜0.01）。结论 肾衰Ⅱ号方可能通过下调 NF-κB/TNF-α 信号通路的表达，改善慢性肾功能衰竭微炎症状态，减轻肾间质纤维化，达到延缓肾功能减退的作用。

关键词：肾衰Ⅱ号方；NF-κB/TNF-α信号通路；微炎症状态；慢性肾脏病；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0058-06

Effects of Shenshuai Ⅱ Decoction on NF-κB /TNF-α Signaling Pathway Expressions in Renal Tissues of Chronic Renal Failure Rats

YANG Jing, ZHU Ting-ting, WANG Chen Department of Nephrology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China Abstract: Objective To observe the effects of Shenshuai Ⅱ Decoction on NF-κB /TNF-α pathway expressions in the renal tissues of chronic renal failure rats; To explore the mechanism of improving chronic inflammation of chronic renal failure and delaying the progression of chronic kidney disease. Methods Rats, which were made into chronic renal failure animal models by means of 5/6 ablation/infarction, were divided randomly into model group, Western medicine control group, and Shenshuai Ⅱ Decoction group, with 14 rats in each group. Meanwhile, sham-operation group was set up with 14 rats. Each administration group was given relevant medicine for intervention. SCr, BUN, and CCr were tested. Western blot was used to detect the expression of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and TNF-α protein. RT-PCR was used to determine the expression of TNF-α mRNA. Results Compared with the sham-operation group, the levels of SCr and BUN in the model group increased significantly, while CCr decreased significantly (P<0.01), and the left kidney mass/body mass significantly increased (P<0.05). The p-NF-κB p65, NF-κB p65 and TNF-α in renal cortex and medulla increased significantly (P<0.01). Compared with the model group,

the levels of SCr and BUN in the Shenshuai Ⅱ Decoction group and the Western medicine control group were significantly lower (P<0.05, P<0.01), while CCr was significantly higher (P<0.01), and the left kidney mass/body mass was significantly reduced (P<0.05). Shenshuai Ⅱ Decoction group was superior to Western medicine control group in improving renal function (P<0.05). The expressions of p-NF-κB p65, NF-κB p65 and TNF-α in renal cortex and medulla of Shenshuai Ⅱ Decoction group and Western medicine control group were significantly decreased (P<0.01). The expression of NF-κB/TNF-α signaling pathway in Shenshuai Ⅱ Decoction group was superior to that of Western medicine control group (P<0.01). Conclusion Shenshuai Ⅱ Decoction can improve the micro-inflammatory state of chronic renal failure, reduce renal interstitial fibrosis, and delay the effect of renal dysfunction by down-regulating the expression of NF-κB/TNF-α signal pathway expressions.

Keywords: Shenshuai Ⅱ Decoction; NF-κB/TNF-α pathway; micro-inflammatory state; chronic kidney disease; rats

微炎症状态普遍存在于慢性肾脏病进展中，加速

病情恶化[1-2]。肾脏既是内分泌调节器官，又是重要的排泄器官。病理情况下，肾脏排泄功能减退、炎症因子清除减少；同时，慢性肾脏病（chonic kidney disease，CKD）激发免疫应答诱导炎症释放，引发慢性、进展性、隐匿性的慢性全身性炎症反应状态——

微炎症状态[3]。微炎症状态下诱导大量促炎因子浸润，活化下游相关信号通路，引起细胞外基质成分沉积、破坏肾脏本身的固有结构组织，形成肾间质纤维化，致使肾脏正常生理功能进一步丧失而发展为终末期肾功能衰竭。前期研究发现，肾衰Ⅱ号方能降低CKD

患者体内的炎症因子表达[4]，抑制肾间质炎性细胞浸

润、减轻肾间质纤维化[5]，延缓 CKD 进展[6]。本研究观察补益脾肾、泄浊解毒化瘀为主要功效的肾衰Ⅱ号方对5/6肾切除大鼠肾组织NF-κB/TNF-α信号表达的影响，探讨该方改善慢性肾功能衰竭微炎症状态、延缓 CKD进展的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级 8周龄雄性SD 大鼠 69 只，体质量 190～

210 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号 SCXK（沪）2012-0002。饲养于上海曙光医院

实验动物中心，温度（22±2）℃，相对湿度（55±2）%，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

肾衰Ⅱ号方（党参15 g、淫羊藿 15 g、丹参 15 g、当归 15 g、制大黄 15 g、桃仁 15 g、川芎 15 g、虫草菌丝 5g等），上海中医药大学附属曙光医院制剂科制备，上药加水煎煮2次，煎液过滤合并，浓缩至浸膏，加乙醇使含醇量至50%，冷藏 24 h，取上清液回收乙醇，浓缩配制为含原药材7.58 g/mL 的混悬液。氯沙坦钾片，杭州默沙东制药有限公司，批号201410；福辛普利钠片，中美上海施贵宝制药有公司，批号

201412。氯沙坦钾、福辛普利钠按照成人用量的 20倍，配制成含药量为 6.42 mg/mL 的混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

Western blot 条带荧光分析系统（ ChemiScope series，Clinx Sciences Instruments Co.Ltd），荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems 7900HT，Funglyn Biotech Incorporated ）， NanoDrop2000 超微量分光光度计

（Thermo，ND2000），兔抗大鼠单克隆磷酸化核因子-κB （ p-NF-κB ） p65 抗体（美国 cell Signaling，批号

#3033s），兔抗大鼠单克隆 NF-κB p65 抗体（美国 cell

Signaling，批号#8242s），兔抗大鼠 TBP 抗体（美国cell Signaling，批号#8515），兔抗大鼠肿瘤坏死因子-α （TNF-α）抗体（Abcam 公司，批号 ab66579），山羊抗兔 HRP标记二抗（美国 Jackson 公司，进口分装，

bs-0295G-HRP），核蛋白提取试剂盒（Best-Bio 贝博

公司，BB-3102-1）。2 实验方法

2.1 分组及造模

健康成年雄性SD 大鼠 69只，随机抽取14 只为假手术组，麻醉后行肾包膜分离手术，余下 55 只大鼠行 5/6（ablation/infarction，A/I）肾切除法制作慢性肾功能衰竭大鼠模型。造模4周后检测血生化指标验证模型成功，将成模存活大鼠随机分为模型组、西药对照组、肾衰Ⅱ号方组，每组14 只。

2.2 给药

肾衰Ⅱ号方组给予肾衰Ⅱ号方（7.58 g/mL）药液灌胃，西药对照组给予氯沙坦钾＋福辛普利钠药液

（6.42 mg/mL）灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积2 mL，每日 1次，连续 60 d。

2.3 生化指标检测

大鼠 2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻

醉，抽血，5000 r/min 离心 15 min，-80 ℃冰箱保存。全自动生化分析仪检测肾功能，包括血肌酐（SCr）、

尿素氮（BUN）。测定尿量、尿肌酐，用内生肌酐清除率（CCr）代替肾小球滤过率：CCr（mL/min）＝

尿肌酐×24 h 尿量÷SCr×1440。

2.4 体质量、左肾质量测定电子秤测量大鼠体质量，精密天平测定左肾质量。

2.5 Western blot 检测肾组织核因子-κB蛋白表达蛋白提取按照 BCA 蛋白质定量试剂盒说明书操

作，核蛋白提取按照试剂盒说明进行。10%SDS-PAGE

凝胶电泳，45 μg/跑道，半干转膜法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h ，分别加兔抗大鼠 TNF-α 一抗（ 1 ∶1000）、兔抗大鼠 NF-κB p65 一抗（ 1 ∶800），兔抗大鼠一抗 p-NF-κB p65（ 1 ∶800）、核内参 TBP一抗（ 1 ∶1000）、兔抗大鼠 β-actin 一抗（ 1 ∶5000），

4 ℃摇床过夜，0.01%PBS-T 洗膜后，HRP 标记的山羊抗兔二抗1 ∶5000 室温孵育2 h，0.01%PBS-T 洗膜

10 min/次，共 3 次，ECL 发光，采用 ChemiScope series系统对发光条带进行拍照和图像的灰度分析。以TNF-α/β-actin 衡量TNF-α表达。以 p-NF-κB p65/TBP、NF-κB p65/TBP 衡量 NF-κB 表达。

2.6 实时定量 PCR 检测肾组织肿瘤坏死因子-α mRNA 表达

采用 Trizol 法提取大鼠肾皮质和髓质RNA，按反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，通过实时定量PCR仪检测肾皮质和髓质TNF-α mRNA 的表达。大鼠 GADPH 为内参，上游引物：5'-CCATCTTCCAGG

AGCGAGATCC-3'，下游引物：5'-GGCCCCACCCTT

CAGGTGAGCC-3'。大鼠 TNF-α，上游引物：5'-GGC

TGAGCCAGCGTGCCAACG-3'，下游引物：5'-GCAG

CCTTGTCCCTTGAAGAG-3'。反应条件：95 ℃变性

30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40个循环。每个样本在 PCR 仪器中扩增需要 3 个复孔，ABI 实时荧光定量 PCR仪监测记录数据并自动计算得出结果。3 统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，采用方差分析，组间比较用 t 检验，多重比较用 LSD 法。P＜0.05表示差异有统计学意义。4 结果

4.1 一般情况

造模手术 4 周后大鼠出现不同程度的进食量减少，体质量减轻，反应迟钝，体毛稀疏散乱伴光泽度下降，假手术组大鼠则无此表现。

4.2 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠体质量、左肾质量/体质量比值的影响

与假手术组比较，模型组大鼠体质量明显降低，

左肾质量/体质量比值明显升高（P＜0.01）；与模型比较，西药对照组、肾衰Ⅱ号方组大鼠体质量明显升高，

左肾质量/体质量比值明显降低（P＜0.05）。见表1。—

4.3 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠血肌酐、尿素氮和内生肌酐清除率的影响

与假手术组比较，模型组大鼠SCr、BUN 水平明显升高，CCr 水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，西药对照组和肾衰Ⅱ号方组大鼠SCr、BUN 水平明显降低，CCr 水平明显升高，差异有统计学意义

（P＜0.05，P＜0.01），肾衰Ⅱ号方组效果优于西药对

照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。—

4.4 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠肾组织核因子-κB p65、磷酸化核因子- κB p65蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肾脏皮质和髓质p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达明显升高，差异有

统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，西药对照组和肾衰Ⅱ号方组大鼠肾脏皮质、髓质p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达明显降低，差异有统计学意义

（P＜0.01），肾衰Ⅱ号方组效果优于西药对照组，差

异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表3、图 1。

4.5 肾衰Ⅱ号方对模型大鼠肾组织肿瘤坏死因子-α蛋白和 mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肾脏皮质和髓质TNF-α 蛋白和 mRNA 表达明显升高，差异有统计学

意义（P＜0.01）；与模型组比较，西药对照组和肾衰Ⅱ号方组皮质、髓质 TNF-α 蛋白和 mRNA 表达明显

降低，差异有统计学意义（P＜0.01），肾衰Ⅱ号方组

作用优于西药对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见图2、表 4。

5 讨论炎性细胞浸润是肾纤维化的启动因素。微炎症状态下，大量炎症因子沉积在包括肾小球、肾小管间质、管周微循环的肾组织中，肾素-血管紧张素系统激活，促进血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）生成，上调转化生长因子-β（TGF-β）表达，细胞外基质（ECM）过度沉积，促进纤维化生成。因此，改善微炎症状态，抑制相关炎症因子表达、减少炎性细胞浸润，能够在一定程度上缓解肾纤维化程度。

NF-κB/TNF-α 信号通路是参与炎症反应、促进炎性细胞浸润的重要信号通路，推动慢性肾脏病微炎症

状态的发生发展[7-9]，在多种肾脏相关疾病中诱导肾

脏实质损伤的发生[10-11]。NF-κB 是连接胞浆胞核炎症表达的重要转录因子，作为炎症反应网的核心调控相

关蛋白因子的表达[12]。NF-κB 家族包括 p65（Rel A)、Rel B、c-Rel、p50/p105（NF-κB1）和 p52/p10（0 NF-κB2）这 5 种类型，N 端具有一个含有二聚体化区、DNA结合区和核定位信号区Rel同源区，能够与IκB 结合。

p50/p65 存在于细胞质，与 IκB 结合形成三聚体，处于静息状态。当 NF-κB 信号通路被细胞外信号刺激后，Iκκ 的 Iκκpβ 亚单位磷酸化，IκBα Ser32 和 Ser36

位点磷酸化，p50/65得以释放，从胞浆转至胞核，进行核易位，与基因上的 κB 位点发生特异性结合，调节下游相应的细胞功能。NF-κB直接参与肾小管间质

纤维化的发生[13-16]。由肾小管上皮细胞释放，引发单

核细胞大量聚集，导致肾组织炎症[17]。NF-κB 被抑制，肾小管上皮细胞中平滑肌肌动蛋白阳性细胞数减少，肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化的发生率降低， ECM合成降低，纤维化减轻，肾脏损伤程度降低[18]。活化后的 NF-κB 诱发下游促炎因子 TNF-α 生成[19]， TNF-α 代表微炎症状态的存在[20]，是衡量微炎症水平的敏感指标。

TNF-α可由肾小球系膜细胞分泌，是导致肾小球系膜基质增生、促进肾小管上皮细胞的增殖与分化、系膜细胞增殖、肾小球硬化和病变进展恶化的重要因素之一，可促进炎症反应和间质细胞增殖分化，直接

或间接促进 ECM 的合成[21-22]。TNF-α 水平与肾功能

水平呈显著负相关。有研究表明，5/6 肾切除慢性肾功能衰竭大鼠模型血清及肾组织 TNF-α 水平显著升高，与 NF-κB的活化及巨噬细胞浸润相关。肾间质浸润的巨噬细胞、小管上皮细胞和肾小球系膜细胞均可产生大量 TNF-α[23]。在器官纤维化中，NF-κB 可促进

TNF-α、白细胞介素-8 和 TGF-β 等细胞因子的基因转录，介导纤维化发生。NF-κB 诱导 TNF-α 的活化[24-25]，促进炎性浸润。总之，NF-κB/TNF-α 信号转导活化后，诱导肾组织内的炎性浸润，引导炎性反应，促进肾脏固有细胞表型转化、分泌具有肾毒性作用的细胞因子，导致成纤维细胞增生分化，从上皮细胞转化为间充质细胞形成肌成纤维细胞，肾小球硬化、小管萎缩、间质纤维化，有效肾单位数量减少，进行性肾功能恶化。

微炎症状态根据其机制分析及临床症状表现，可归属于中医学“浊毒”“湿热”等范畴。慢性肾功能衰竭责之脾肾脏腑不足，所谓“肾如薪火，脾如鼎釜”。脏腑正气虚弱，气化无权，气血津液运行不畅，水液运行受阻，水湿内盛，聚而不化，酿生湿浊之邪；湿浊内蕴，日久化为湿热；湿浊内阻，阻遏三焦，三焦为水液运行之通道，三焦不利，浊毒内蕴。湿性胶着黏腻难去，浊毒之邪久居，气血阻滞，正气不足，加

重病情[26]。虚实错杂，邪正交阻，脾肾阳气节节衰败，气血虚弱之势重，湿浊瘀毒夹杂。故目前有观点将慢

性肾功能衰竭的微炎症状态概括为“毒损肾络”[27]。肾衰Ⅱ号方以调理脏腑、扶正降浊为主。方取党参、淫羊藿为君，党参补中益气，淫羊藿温补肾气，二药共用温补脾肾之功著，寓培本固源以扶助正气。当归补血活血，丹参、当归共用为臣，加入川芎、桃仁则化瘀力甚，使瘀血得化、新血得生。佐大黄破积行瘀、推陈致新，紫苏叶解血中之毒。四药合用，湿浊之毒、瘀热之毒均可祛除。虫草菌丝专补命门之火，黄连清热解毒、苦寒坚阴。全方寒温并用、攻补兼施，补虚不留邪，祛邪不伤正，共奏补益脾肾、泄浊解毒之效。

综上，肾衰Ⅱ号方可明显改善慢性肾功能衰竭大鼠肾功能，SCr、BUN 水平降低，CCr水平升高，下调 NF-κB/TNF-α 信号通路表达，减轻残肾组织间质炎性细胞浸润、改善肾间质纤维化程度。本研究发现，以温补脾肾、降浊解毒泄浊为主的肾衰Ⅱ号方可能是通过调节 NF-κB/TNF-α 信号转导，改善慢性肾功能衰竭大鼠的微炎症状态，减轻肾间质纤维化进程，从而改善肾功能，延缓慢性肾功能衰竭进展。

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（收稿日期：2018-01-04）

（修回日期：2018-02-10；编辑：华强）

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