CJI (Traditional Chinese Medicine)
基于近红外漫反射光谱指纹图谱的当归-川芎药对配伍研究
顾志荣1，沈丹丹2，许爱霞1，郑修丽1，钱倩1，萨日娜1，张瑛 3，葛斌 1
1.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；
3.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地，甘肃 兰州 730000
摘要：目的 建立当归、川芎单煎及当归-川芎 1∶1 合煎水煎液干燥恒重粉末的近红外漫反射光谱（NIRDRS）指纹图谱，从近红外光谱的角度初步探讨当归-川芎配伍的物质基础。方法 以积分球漫反射方式采集各 50批当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1合煎干燥恒重粉末的NIRDRS指纹图谱，提取指纹图谱共有模式并作光谱解析，比较3种指纹图谱的差异光谱并进行相似度分析，建立正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型对 3 种指纹图谱进行分类鉴别，采用载荷分析识别当归-川芎配伍合煎后的主要标记性化学基团变化。结果 当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1 合煎 NIRDRS指纹图谱的共有模式较为相似；相似度分析表明，当归、川芎单煎与当归-川芎1∶1合煎的 NIRDRS指纹图谱相似度均大于0.90，但川芎单煎的平均相似度小于当归单煎；所建立的 OPLS-DA模型能够实现当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1 合煎 NIRDRS指纹图谱的分类鉴别，表明 3 种指纹图谱存在显著区别；光谱差异分析及载荷分析表明，3 种 NIRDRS 指纹图谱的光谱差异分布在
9761～9016 cm-1、7449～6997 cm-1、6880～6928 cm-1、5561～5352 cm-1、5291～5196 cm-1、4296～4211 cm-1波数范围内。结论 与当归、川芎单煎比较，当归-川芎1∶1配伍合煎表现为新出现某些化合物基团，同时某些化合物基团消失或降低。
关键词：当归；川芎；配伍；近红外漫反射光谱；指纹图谱；正交偏最小二乘-判别分析；载荷分析；物质基础
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.015
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0064-06
Study on Compatibility of Angelica Sinensis Radix and Ligustic Rhizoma Based on NIRDRS Fingerprints
GU Zhi-rong1, SHEN Dan-dan2, XU Ai-xia1, ZHENG Xiu-li1, QIAN Qian1, SA Ri-na1, ZHANG Ying3, GE Bin1
1. Gansu Provincial People’s Hospital, Lanzhou 730000, China; 2. College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of TCM Quality and Standard in Gansu Province, Lanzhou 730000, China
Abstract: Objective To establish the near-infrared diffuse reflectance spectroscopy (NIRDRS) fingerprints of dry constant weight powders of decoction of Angelica Sinensis Radix, Ligustic Rhizoma, and Angelica Sinensis Radix - Ligustic Rhizoma at a ratio of 1:1; To preliminarily investigate the material basis of its compatibility from perspective of near infrared spectroscopy. Methods The NIRDRS fingerprints of each 50 batches of Angelica Sinensis Radix, Ligustic Rhizoma, and Angelica Sinensis Radix - Ligustic Rhizoma at a ratio of 1:1 were collected by integrating sphere diffuse reflectance method. The common model of fingerprints were extracted and the spectral analysis was carried out. The different spectra of the three fingerprints were compared and the similarity analysis was
carried out. The orthogonal partial least squares - discriminant analysis (OPLS-DA) model was used to classify the three fingerprints, and the loading analysis was used to identify the major markers of chemical functional groups of compatibility of Angelica Sinensis Radix and Ligustic Rhizoma. Results The common model of NIRDRS fingerprints of Angelica Sinensis Radix and Ligustic Rhizoma were similar with that of Angelica Sinensis Radix - Ligustic Rhizoma at a ratio of 1:1. The similarity analysis showed that the similarity of NIRDRS fingerprints of Angelica Sinensis Radix, Ligustic Rhizoma and Angelica Sinensis Radix - Ligustic Rhizoma at a ratio of 1:1 were all more than
0.90, but the average similarity of Ligustic Rhizoma was less than Angelica Sinensis Radix. The established OPLS-DA model can be used to classify the NIRDRS fingerprints of Angelica Sinensis Radix, Ligustic Rhizoma and Angelica Sinensis Radix - Ligustic Rhizoma at a ratio of 1:1, which indicated that the three fingerprints were significantly different. Spectral difference analysis and loading analysis showed that the wavenumbers of the differences of three NIRDRS fingerprints mainly existed in the ranges of 9761–9016 cm-1, 7449–6997 cm-1,
6880–6928 cm-1, 5561–5352 cm-1, 5291–5196 cm-1, and 4296–4211 cm-1. Conclusion Compared with Angelica Sinensis Radix decoction and Ligustic Rhizoma decoction, the compatibility of Angelica Sinensis Radix and Ligustic Rhizoma decoction at a ratio of 1:1 shows some new functional groups, and some functional groups disappear or decrease.
Keywords: Angelica Sinensis Radix; Ligustic Rhizoma; compatibility of medicine; near infrared diffuse reflectance spectroscopy; fingerprints; orthogonal partial least squares - discriminant analysis; loading analysis; material basis
药对是中医方剂中以固定形式存在的两味中药的配伍，可产生作用相加、协同增效、降低烈性等药物相互作用，被认为是中医方剂发挥功效主治的的基础作用单元。当归-川芎是中医临床常用的补血、活血药对，其中当归养血补血，川芎行血散血，两药配
伍可协同增强养血和血、活血袪瘀之功[1]。现代药理研究表明，当归-川芎药对能明显改善梗死区血液循环、抗脑缺血/再灌注损伤、解痉、补血、改善血瘀状
态下机体的血液流变学及抗凝血[2-3]。近年对当归-川
芎药对在古方中的用药规律、临床用药特征[4]，以及
药理药效、指标性成分含量[5]、谱效关系[6]等方面展开了广泛研究，初步揭示了二药配伍的协同增效作用及临床组方规律。研究表明，当归-川芎以1∶1 配伍
比例使用的频次最高[4]。本研究建立当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1合煎水煎液干燥恒重粉末的近红外漫反射光谱（NIRDRS）指纹图谱，解析、比较指纹图谱的光谱差异，建立正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型识别当归-川芎合煎的主要标记性化学基团变化，以期从近红外光谱的角度初步阐释当归-川芎配伍的物质基础。
1 仪器与试药
Antaris 近红外光谱仪（美国 Thermo 公司），配有积分球模块、RESULT3.0 光谱采集软件和 TQ
Analyst 8.0 化学计量学软件；YC-1000 型实验室喷雾（流化床）造粒机（上海雅程仪器设备有效公司）。
当归、川芎单煎液的干燥恒重粉末各 50 批（分别编号为 DG1～DG50 及 CX1～CX50），当归-川芎
1∶1 合煎液的干燥恒重粉末 50 批（编号为 GX1～
GX50）。当归、川芎单煎液及当归-川芎 1∶1 合煎液的干燥粉末均采用喷雾干燥法制备，设备参数为：热风流量40 m3/h，进风温度 120 ℃，雾化器压力0.1 MPa，蠕动泵进料速度300 mL/h。当归、川芎饮片均购自甘肃冠兰中药饮片有限公司，批号分别为 20160812、
20161105，经甘肃省人民医院药剂科郑修丽副主任中药师鉴定，当归饮片为伞形科植物当归 Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，川芎饮片为伞形科植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。2 方法与结果2.1 样品指纹图谱采集及光谱解析取干燥至恒重的当归、川芎单煎液及当归-川芎
1∶1合煎液样品粉末，以积分球漫反射方式进行光谱
采集。光谱采集条件[7]：扫描范围 10 000～4000 cm-1，扫描次数 32次，设定分辨率8 cm-1，扫描温度 20 ℃，空气相对湿度70%。以空气为参比，每批样品均重复采集 3次，取平均光谱。采用 OMNIC8.2 光谱处理软
件对采集的原始光谱数据进行基线校正、9 点 SG 平滑滤波及 Noise 去噪等预处理[8]。
当归、川芎及当归-川芎1∶1合煎水煎液干燥粉末的 NIRDRS 指纹图谱分别见图1～图 3。为便于比较分析，将3种指纹图谱的共有模式（平均光谱）绘
制在一张坐标上，见图 4。3 种 NIRDRS 指纹图谱共有模式的光谱解析见表1。
2.2 差异光谱及相似度分析
由图 4 可知，当归、川芎单煎及当归-川芎 1∶1合煎的 NIRDRS指纹图谱共有模式较为相似，原始光谱难以直观看出其区别，故求取三者的一阶导数光谱进行比较，见图 5。可以直观看出，3 种 NIRDRS 指纹图谱的主要差异集中在 A（9840～9162 cm-1）、B
（7452～7033 cm-1）、C（5548～5193 cm-1）3 个区间，
3个波数区间的放大光谱见图6～图 8。
以 50 批当归-川芎 1∶1 合煎 NIRDRS 指纹图谱的共有模式作为对照指纹图谱，采用相关系数法计算当归及川芎单煎 NIRDRS 指纹图谱的相似度[9]，结果见表 2。可见，当归、川芎单煎与当归-川芎 1∶1 合煎的 NIRDRS指纹图谱相似性较大；当归单煎的平均相似度为 0.971，川芎为 0.964；相似度＜0.95 的当归单煎干燥粉末有 9 批，川芎有 16 批。说明两药配伍合煎后，川芎产生的变化较当归更大，这也清晰反映在图6～图 8中的差异吸收峰上。
图 6中，在 9840～9162 cm-1范围内，当归-川芎
1∶1 合煎水煎液干燥粉末的 NIRDRS 一阶导数光谱与当归水煎液干燥粉末相比，新出现了吸收峰c、j、k、l；与川芎水煎液干燥粉末相比，未出现吸收峰a、b、d、e、f、g、h、i、m。图 7 中，在 7452～7033 cm-1范围内，当归-川芎 1 ∶ 1 合煎水煎液干燥粉末的NIRDRS一阶导数光谱与当归水煎液干燥粉末相比，新出现了吸收峰a、d、e、f、g，未出现吸收峰 b、c、j；与川芎水煎液干燥粉末相比，未出现吸收峰c、h、i，新出现吸收峰 e、f、g。图 8 中，在 5548～5139 cm-1范围内，当归-川芎 1 ∶ 1 合煎水煎液干燥粉末的NIRDRS一阶导数光谱与当归水煎液干燥粉末相比，新出现了吸收峰b、c，未出现吸收峰a；与川芎水煎液干燥粉末相比，未出现吸收峰 d。上述分析表明，在一定波数范围内，当归与川芎配伍合煎表现为新出现某些化合物基团，同时某些化合物基团消失或降低。
2.3 指纹图谱正交偏最小二乘-判别分析
基于 NIRDRS 指纹图谱，对3种指纹图谱原始光谱进行正交信号校正，建立 OPLS-DA 的模式识别模
型[10]，对当归、川芎单煎及当归-川芎 1∶1合煎进行分类鉴别，并采用载荷分析确定引起其分类差异的光谱，识别当归、川芎 1∶1 配伍后产生的物质变化基础。本研究所建 OPLS-DA 模型的 R2X 与 R2Y（均表
2示模型的拟合程度）分别达到 0.937 与 0.956，Q （表示模型的预测能力）达到 0.924，说明模型的拟合程度及预测能力均良好，符合NIRDRS 指纹图谱分类鉴别的要求。OPLS-DA 三维模式投影图及二维载荷图分别见图9、图 10。
由图9可以看出，除个别样本离群外，当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1合煎的NIRDRS指纹图谱可在 OPLS-DA 模型中明显分类聚集，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类分别是当归单煎、川芎单煎、当归-川芎1∶1合煎水煎液干燥粉末的 NIRDRS 指纹图谱，说明3种指纹图谱
存在显著区别。其中，Ⅰ类主要位于第一主成分（t[1]）的负象限，Ⅱ类位于 t[1]、t[2]、t[3]的正象限，Ⅲ类位于 t[1]的正象限。OPLS-DA 模型 t[1]的方差贡献率达到 71.95%，即能够解释原变量的 70%以上的信息，聚类结果位于 t[1]正象限者其指纹图谱吸收峰较多且吸光度较大。
在图 10载荷图中，每个点代表一个变量（波数），距离原点越远表示变量的权重越大，说明该变量的变化对各类样品指纹图谱的分类鉴别作用越大。本研究选择变量重要性投影值（variable importance in projection，
VIP）＞1 的变量作为贡献较大的变量[11]，载荷图中
在圆圈外的变量离原点较远（VIP＞1），可作为当归、川芎单煎及当归-川芎1∶1合煎NIRDRS指纹图谱差异的主要标记性变量，这些变量所在的主要波数范围分布在 9761～9016 cm-1、7449～6997 cm-1、6880～
6928 cm-1、5561～5352 cm-1、5291～5196 cm-1、4296～
4211 cm-1。3 讨论
本研究建立的 OPLS-DA 模型是一种有监督的模式识别方法，该模型能够有效滤除“脏数据”，其分类鉴别能力比传统的主成分分析（PCA）及偏最小二乘（PLS）更强。本研究中，当归、川芎单煎及当归川芎 1∶1 合煎 NIRDRS 指纹图谱可在 OPLS-DA 模型中明显分类聚集，说明虽然三者NIRDRS 指纹图谱的相似度较高，但通过 OPLS-DA 模型可以实现其分类鉴别，而 OPLS-DA 模型的载荷分析能找出三者NIRDRS指纹图谱分类差异所在的波数或波数范围，从而实现在化合物基团水平上阐释当归-川芎药对配伍的物质基础。OPLS-DA载荷分析确定的当归-川芎
1∶1 合煎后产生变化的主要波数范围分布在 9761～
9016 cm-1、7449～6997 cm-1、6880～6928 cm-1、5561～
5352 cm-1、5291～5196 cm-1、4296～4211 cm-1，而差异光谱分析确定的差异波数范围为 9840～9162 cm-1、
7452～7033 cm-1 及 5548～5193 cm-1，后者包含于前者之中，说明基于 OPLS-DA 模型的载荷分析对于识别归芎药对合煎后产生的物质变化更为有效。
本研究中，川芎位于三维模式投影图中 t[1]、t[2]、
t[3]的正值象限区，而 OPLS-DA 投影中各主成分得分与指纹图谱的吸光度及峰个数有关，这也印证了川芎 的 NIRDRS指纹图谱吸收峰较多且吸光度较大；而川芎与当归合煎后吸收峰明显变少，说明当归与川芎合煎后产生了新的化合物基团，而川芎本身的化合物基
团有所消失或降低。李伟霞[12]研究表明，当归-川芎药对合煎后绿原酸、咖啡酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、藁本内酯和3个芳香酸总和含量增高，而阿魏酸、洋川芎内酯A、丁基苯酞、正丁烯基苯酞和 6
个苯酞内酯总含量降低；周建设等[13]发现当归-川芎
合煎后川芎嗪含量也增高；郁威等[14]发现当归-川芎合煎后提取率明显高于单煎提取率之和。这些研究均说明，当归-川芎合煎后各成分的含量并不是两单味药中各成分含量的简单加和，而是在合煎过程中发生了各成分的相互作用，有的含量增加，而有的则减少，与本研究结果相一致。
在 9840～9162 cm-1 范围内，当归-川芎药对的NIRDRS指纹图谱一阶导数光谱与当归相比，新出现吸收峰c、j、k、l；与川芎相比，未出现吸收峰 a、b、d、e、f、g、h、i、m，说明在此波数范围内，当归合煎后主要表现为某些化合物官能团消失或降低，而川芎合煎后则表现为新出现某些化合物官能团，其原因可能与2种中药所含的化学成分差异有关。研究发现，虽然当归与川芎所含的化学成分种类较为相似，但川芎所含挥发油成分的种类和含量明显多于当归，
如川芎中内酯类成分的种类即多于当归[15]；川芎尚含有当归不含的生物碱成分川芎嗪、酚类化合物川芎酚等，三糖及含有丁烯基苯酞结构的一类化合物在当
归、川芎水煎液中含量也存在明显差异[16]，这些可能是当归与川芎配伍合煎后许多化合物官能团消失或降低的主要原因之一。
药对是中医遣方用药时从单味药到方剂的中间环节，是中医理论和临床实践经验的结晶，而直接研究组成药味较多的中药方剂目前仍面临许多困难。因此，从药对入手开展中药方剂配伍研究，可作为揭示方剂配伍规律的简单模型，是目前普遍采用的探讨复杂方剂配伍规律的有效途径。迄今，对于药对或复杂方剂的研究热点为基于古代方剂或中医应用的数据挖掘研究，以及药对干预模型实验动物的药理机制探讨，但此类研究难以在物质基础层面揭示配伍的本质规律。近红外光谱技术是一种快速、无损的绿色分析技术，目前在中药研究中得到广泛应用。本研究从化合物基团的角度初步探索了当归-川芎药对配伍的物质基础，在后续研究中，将借助红外光谱与液相色谱、气相色谱等相结合的技术平台，从有效部位及代谢组学角度深入阐释当归-川芎药对配伍的物质基础。
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（修回日期：2017-12-09；编辑：陈静）