CJI (Traditional Chinese Medicine)
益气复脉冻干粉与其单味药配方液HPLC指纹图谱差异性研究
刘红宇1,徐玉琴1,欧阳婷1,张雅铭2,刘文龙3,贺映辉 1
1.湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;2.解放军 302医院全军中医药研究所,北京 100039;
3.湖南中医药大学药学院,湖南 长沙 410208
摘要:目的 研究益气复脉冻干粉与其单味药配方液的 HPLC 指纹图谱差异性,为进一步探索其类致敏成分提供基础。方法 采用 Scienhome Kromasil ODS 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长 206 nm,柱温 30 ℃。结果 建立了注射用益气复脉冻干粉高效快速的检测分析方法,以人参皂苷 Rg1为参照物峰,确定了 17 个共有峰。制剂与其单味药配方液图谱比较,显示在 13~17 min、46 min的峰有明显差异,提示可能是寻找类致敏成分的突破口。结论 本研究建立了一种稳定、快速、有效且重复性好注射用益气复脉冻干粉的质量控制方法,同时为探索该制剂的类致敏成分提供了基础。关键词:注射用益气复脉冻干粉;单味药配方液;高效液相色谱法;指纹图谱;相似度评价
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.016
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)08-0070-05
Study on Difference of HPLC Fingerprints Between Yiqi Fumai Injection and Single Herb Formula Liquid
LIU Hong-yu1, XU Yu-qin1, OUYANG Ting1, ZHANG Ya-ming2, LIU Wen-long3, HE Ying-hui1
1. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China;
2. China Military Institute of Chinese Medicine, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China;
3. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
Abstract: Objective To study the difference of HPLC fingerprints between Yiqi Fumai Injection and its single herb formula liquid; To provide a basis for further study of its allergenic ingredients. Methods The HPLC analysis was performed on a Scienhome Kromasil ODS column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and the mobile phase consisted of
acetonitrile-0.05% phosphoric acid by stepwise gradient elution. The flow rate was 1 mL/min and the detective wavelength was set at 206 nm. The column temperature maintained at 30 ℃. Results A more efficient and rapid method for the detection and analysis of Yiqi Fumai Injection was established. With ginsenoside Rg1 as the reference peak, 17 common peaks were identified. The spectra between Yiqi Fumai Injection and its single herb formula liquid showed significant differences in the peaks of 13–17 min and 46 min, suggesting that it may be a breakthrough in the search for allergenic ingredients. Conclusion A stable, rapid, effective and reproducible method was established for quality control of Yiqi Fumai Injection. The study can also provide a basis for exploring the allergenic ingredients of the preparation.
Keywords: Yiqi Fumai Injection; single herb formula liquid; HPLC; fingerprint; similarity evaluation 中药注射剂成分复杂,筛查其致敏成分有很大难度。中药注射剂引起的过敏反应主要分为Ⅰ型(速发 型)、Ⅱ型(细胞毒型)、Ⅲ型(免疫复合型)、Ⅳ型(迟发型),其中由 IgE 介导的Ⅰ型过敏反应在临床上最为常见。目前的致敏原检测方法主要有皮肤(全身)主动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验(MEST)、豚鼠最大值法(GPMT)等[1-4],但这些检测方法仅适用于单一致敏成分的筛查。本课题组针对最常见的Ⅰ型
过敏反应,拟先采用高效液相色谱/质谱、气相色谱/质谱分析特异性抗体lgE所作用的特异性成分,然后用针对动物实验的抗原抗体作用人或动物使用中药注射剂致敏所产生的特异性抗体lgE 及成分,通过两种方法联合确定中药注射剂的致敏原。
益气复脉冻干粉处方来源于《内外伤辨惑论》生脉散,具有益气复脉、养阴生津的功效。临床常用于治疗冠心病、劳累型心绞痛、气阴两虚证及冠心病所
致慢性左心功能不全Ⅱ、Ⅲ级[5-6]。其组成为红参、麦冬和五味子,主要有效成分为皂苷类。而皂苷类具有刺激性,静脉输注人体后,可能引起头晕、恶心、呕吐等一系列不良反应,甚至发生过敏反应。因此,益气复脉冻干粉中的皂苷类成分可能是引起过敏及溶血等不良反应的主要物质基础。目前,已报道的注射用益气复脉冻干粉的HPLC指纹图谱研究仅停留在注射剂整体水平,尚未对该制剂的单味药配方液进行研究。为筛选出注射用益气复脉冻干粉的致敏成分,有必要对该制剂及其单味药配方液中的皂苷类成分进行分析研究。
中药指纹图谱建立于中药成分系统研究的基础上,可全面反映中药内在质量和比较全面地测定出制剂中的有效成分、活性成分或指标成分,能从整体上
分析复杂化学物质的组成[7]。注射用益气复脉冻干粉的君药红参成分复杂,皂苷类成分极性相近、结构相似,已报道的指纹图谱的分析时间均大于80 min[8-10],检测时间较长。因此,本研究以注射用益气复脉冻干粉为研究对象,在已有文献研究的基础上建立快速、高效的注射用益气复脉冻干粉指纹图谱分析方法,着重对皂苷类成分进行鉴定与分析,比较益气复脉冻干粉与其单味药配方液的HPLC指纹图谱差异性,为后续探索该制剂的类致敏成分提供基础。
1 仪器与试药
Aglient 1100 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),AUX 220万分之一电子分析天平(日本岛津公
司),KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声
仪器有限公司),DK-98-1 型数显电热水浴锅(天津
市泰斯特仪器有限公司),98-1-B 型电子调温电热套
(天津市泰斯特仪器有限公司),RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
注射用益气复脉冻干粉[天津天士力之骄药业有限公司,批号分别为 20161016(S1)、20161017(S2)、
20161018(S3)、20161019(S4)、20161101(S5)、
20161102(S6)、20161103(S7)、20161104(S8)、
20161105(S9)、20161106(S10)],人参皂苷 Rb1 对照品(上海源叶生物科技有限公司,批号
Z04D6X7135,纯度≥98%),人参皂苷 Rg1对照品(中国食品药品检定研究院,批号 11003-200322),磷酸(天津市大茂化学试剂厂,分析纯),乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯),甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。红参、麦冬、五味子,天津天士力之骄药业有限公司提供,经湖南中医药大学第一附属医院刘绍贵主任药师鉴定,符合 2015 年版《中华人民共和国药典》各药项下规定。2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液
取适量人参皂苷Rg1和人参皂苷 Rb1对照品,精密称定,用甲醇溶解,分别制成浓度为6.53 mg/mL、
6.39 mg/mL 的对照品溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。
2.1.2 单味药配方溶液
3 种单味药配方溶液的提取方法参照国家食品药品监督管理总局《国家药品标准》中“益气复脉冻干
粉(冻干)标准(YBZ07062006-2009Z-2011-2014)。分别称取红参10 g、麦冬 30 g、五味子 15 g。红参用乙醇回流提取3 次,第 1、2 次各3 h,第 3 次 2 h,合并提取液,减压回收乙醇至无醇味,加水至约10 mL,冷置,分离除去上层油,水层过滤,滤液减压浓缩后,
70 ℃以下减压干燥,即得红参提取物。麦冬、五味子分别加水煎煮3次,第1 次1h,第 2 次 45 min,第 3 次 30 min,合并各自提取液,分别减压浓缩至相对密度为麦冬 1.15~1.20(50 ℃)、五味子 1.16~1.21
(50 ℃),各加乙醇至含醇量为75%,放置,过滤,滤液分别减压浓缩至相对密度为麦冬 1.25 ~ 1.30
(50 ℃)、五味子 1.18~1.23(50 ℃),分别再加乙醇至含醇量为85%,放置,过滤,加氢氧化钠溶液调节 pH值分别为9(麦冬)、7(五味子),放置,过滤,麦冬滤液加稀盐酸调 pH 值为 6.5~7.0,滤液分别减
压回收乙醇后,70 ℃以下减压干燥,即得麦冬和五味子提取物。
上述3种提取物分别加10 mL甲醇溶解,合并,
0.45 μm微孔滤膜过滤,得红参、麦冬和五味子混合母液。取 0.3 mL混合母液,加 0.2 mL甲醇稀释,即得与样品剂量相当的单味药配方混合溶液(以下简称“配方液”)。
2.1.3 供试品溶液取注射用益气复脉冻干粉1.3 g(约 2瓶量,提取
工艺与3种单味药提取工艺相同),精密称定,加5 mL
甲醇溶解,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。
2.2 色谱条件
色谱柱:Scienhome Kromasil ODS(250 mm×
4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.05%磷酸(B),按表 1程序梯度洗脱;流速:1 mL/min;检测波长:
206 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL[8-9]。理论塔板数按人参皂苷 Rb1峰计算应不低于 6000。
2.3测定方法分别精密量取对照品溶液、配方液及供试品溶液
20 μL进样,以人参皂苷Rg1的色谱峰为参照物峰并测定 10批注射用益气复脉冻干粉的指纹图谱。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验取同一注射用益气复脉冻干粉(批号 20161018),
按“2.1.3”项下方法处理,按“2.2”项下色谱条件连 续进样6次,以人参皂苷Rg1的保留时间和峰面积为对照计算,色谱图中各主要共有峰相对保留时间的
RSD<0.78%,相对峰面积的 RSD<1.88%,表明色谱分析系统稳定,仪器精密度较好。
2.4.2 重复性试验取同一批号注射用益气复脉冻干粉(批号
20161018),共 6 份,按“2.1.3”项下方法制备供试
品溶液,按“2.2”项下色谱条件进行检测,以人参皂苷 Rg1的保留时间和峰面积为对照计算,结果各主要共有峰相对保留时间的 RSD<0.65%,相对峰面积的
RSD<1.99%,表明该方法重复性较好,符合指纹图谱分析要求。
2.4.3 稳定性试验取同一注射用益气复脉冻干粉(批号 20161018),
按“2.1.3”项下方法处理,分别于 0、4、8、12、18、
24 h进行检测,结果显示各主要共有峰相对保留时间的 RSD<0.56%,相对峰面积的 RSD<1.95%,表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
2.5 指纹图谱的建立及相似度评价
2.5.1 对照指纹图谱的建立和指纹图谱相似度评价
将“2.3”中所得 10批样品指纹图谱的AIA 数据
文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件,以平均值生成对照指纹图谱(R),进行多点校正,全谱峰匹配,结果见图 1。计算各样品指纹图谱与生成的对照指纹图谱的相似度,结果见表2。
相似度计算结果显示,10批样品指纹图谱相似度均大于 0.990,说明该制剂工艺稳定,制剂中类致敏成分也比较稳定。
2.5.3制剂与配方液的相关性
取配方液 20 μL,注入液相色谱仪,按“2.2”项下色谱条件进样,对比样品和配方液的指纹图谱,见图3。可以看出,保留时间在13~17 min、46 min 处的峰有较大不同,其成分的差异及产生原因有待进一步研究。提示配方液与注射用益气复脉冻干粉指纹图谱的不同之处是寻找注射用益气复脉冻干粉类致敏成分的突破口。
2.5.2共有峰的确定
根据 10 批样品进样结果,选择吸收强、稳定性好、特征明显的色谱峰作为共有峰。因7号峰(人参皂苷 Rg1)在各批样品中含量较高,峰形稳定,与其他峰分离良好,故以其作为参照物峰。以色谱峰对参照物峰的相对保留时间定性,共标定了17个共有峰,结果见图 2。根据测定结果,比较特征色谱图,由各吸收峰与对照品的紫外吸收光谱及相对保留时间可
知,7号峰为人参皂苷 Rg1,8 号峰为人参皂苷Rb1。人参皂苷类成分结构类似,保留时间相近,而且有紫外末端吸收,仅通过与对照品紫外吸收色谱图和相对保留时间做比较,不能准确定性,有待进一步用质谱分析各成分的归属。
3 讨论注射用益气复脉冻干粉中的红参主要成分为人
参皂苷类[11-12],通过紫外扫描发现人参皂苷Rg1和Rb1的最大吸收波长为203 nm。本研究考察了波长203、
206、210、230、254 nm的指纹图谱,结果在203 nm波长条件下基线45 min后漂移较严重,在波长230、
254 nm人参皂苷 Rg1和 Rb1基本不出峰,在波长206、
210 nm色谱峰较多且基线较平稳,但206 nm的色谱峰吸收更强,因此选用 206 nm作为检测波长。为快速、高效得到该制剂指纹图谱,本试验通过改变梯度洗脱条件,大大缩短了检测时间。
本试验绘制了 10 批注射用益气复脉冻干粉样品的指纹图谱,通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统确定了 17个共有峰,相似度均大于0.990,说明产品质量的稳定性和一致性,同时也说明该制剂中的类致敏成分相对固定。本研究着重对方中君药红参的皂苷类成分进行分析,指认了制剂中人参皂苷Rg1和 Rb1,可考虑作为首批筛选致敏成分的对象。
本制剂的辅料为葡甲胺和甘露醇。为筛选出注射用益气复脉冻干粉中的致敏原,本试验按该制剂国家药品标准中的制法对3味药进行提取,制成混合液,与添加辅料的样品指纹图谱进行比较,两者成分大致一样,但在保留时间13~17 min、46 min 处的峰有较大不同。与配方液指纹图谱相比,样品在保留时间
13~17 min 处峰多些,在46 min处峰少。推测其原因,可能是中药成分复杂,在制备过程中发生了某些化学反应;也可能由于皂苷不稳定,在贮藏过程中部分分解,生成了新物质;或某些成分含量显著减少甚至很难检测到。二者成分的差异及产生原因有待进一步研究,但此不同之处是寻找注射用益气复脉冻干粉类致敏成分的突破口,为寻找致敏原提供了方向和新思路。
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(收稿日期:2018-01-09)
(修回日期:2018-02-02;编辑:陈静) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件