消瘀接骨散超高液相色谱指纹图谱研究

宋燕1，朋汤义2，冉姗1，孙方方1，洪燕2，韩燕全 2

1.安徽中医药大学，中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230038；

2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031摘要：目的 建立消瘀接骨散超高液相色谱（UPLC）指纹图谱，为其整体质量控制提供评价方法。方法 采用UPLC-PDA检测法测定10批消瘀接骨散UPLC指纹图谱。色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18

柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为220 nm，柱温 30 ℃，流速 0.2 mL/min。将 10批样品指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》软件进行相似度评价分析，并确定其共有峰；基于得到的共有色谱峰数据，采用SPSS19.0 软件进行系统聚类分析、主成分分析（PCA）。结果 10 批消瘀接骨散指纹图谱共确定了 17 个共有峰，通过对照品比对指认了其中的 6 个色谱

峰（原儿茶酸、阿魏酸、桂皮醛、丁香酚、胡椒碱、欧前胡素），10批样品的相似度介于 0.969～0.998；10 批样品大致可聚成 2 类；PCA 分析了共有峰的主成分分值，其中前 5 个主成分累计变量贡献值达到 91.526%。结论 本研究建立的消瘀接骨散指纹图谱重复性良好，可作为消瘀接骨散的质量评价方法。关键词：消瘀接骨散；超高液相色谱指纹图谱；相似度分析；聚类分析；主成分分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.018

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0080-06

Study on UPLC Fingerprint of Xiaoyu Jiegu Powder

SONG Yan1, PENG Tang-yi2, RAN Shan1, SUN Fang-fang1, HONG Yan2, HAN Yan-quan2

1. Anhui University of Chinese Medicine, Key Laboratory of Chinese Medicine Compound Anhui Province, Hefei 230038, China; 2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Grade 3 Laboratory of

TCM Preparation of State Administration of TCM, Hefei 230031, China

Abstract: Objective To establish the UPLC fingerprint of Xiaoyu Jiegu Powder; To provide an evaluation method for its overall quality control. Methods UPLC-PDA was used to detect the UPLC fingerprints of 10 batches of Xiaoyu Jiegu Powder. The chromatographic conditions were Waters Acquity UPLC BEH C18 column (2.1 mm × 100 mm,

1.7 µm); the mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution, gradient elution; detection wavelength was 220 nm; column temperature was 30 ℃; flow rate was 0.2 mL/min. The similarity of the fingerprints of 10 batches of samples was evaluated by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (2004A) and their common peaks were determined. Based on the common peak data, SPSS19.0 software was used to conduct the system cluster analysis and principal component analysis (PCA). Results A total of 17 common peaks were identified from the fingerprints of 10 batches of Xiaoyu Jiegu Powder, and six peaks (protocatechuic acid, ferulic acid, cinnamaldehyde, eugenol, piperine and imperatorin) were identified by reference substance comparison. The similarity of 10 batches of samples was between 0.969 and 0.998, and 10 batches of samples were clustered into two types. PCA analyzed the principal component scores of the common peaks, among which the first five principal component cumulative variables contribution value reached 91.526%. Conclusion The established UPLC fingerprint of Xiaoyu Jiegu Powder shows good reproducibility and can be used as an evaluation method for the quality of Xiaoyu Jiegu Powder.

Keywords: Xiaoyu Jiegu Powder; UPLC fingerprint; similarity analysis; cluster analysis; principal component analysis

基金项目：国家中医药重点学科临床中药学建设项目（2012年）；安徽中医学院科研项目计划（2012LC1-020B）

通讯作者：韩燕全，E-mail：hyquan2003@163.com

消瘀接骨散是安徽中医药大学第一附属医院全国名中医丁锷主任医师的经验方，由医院制剂中心加工而成散剂，具有活血止痛、消瘀接骨的功效。该处方由五加皮、白芷、川芎、荜茇、桂皮及丁香等7味药组成，临床用于治疗膝关节炎、促进骨折恢复及外

伤肿痛等，疗效显著[1-2]。该制剂目前的质量控制主要为常规制剂通则项目检查，尚缺少定量和定性的研究指标。

中药指纹图谱是建立在中药化学成分系统研究

基础上的一种综合、可量化的中药质量控制手段[3]。由于其具有整体性和模糊性的特点，目前在中药材及中药制剂质量控制研究中应用较多。本研究通过建立

10批消瘀接骨散UPLC指纹图谱，结合相似度、聚类分析和主成分分析（PCA）方法，从多角度评价消瘀

接骨散不同批次样品的质量[4-5]，为该制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Acquity UPLC H-Class 超高效液相色谱系统（美国 Waters 公司），配四元超高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和 Empower2 色谱工作站；

AG285十万分之一电子天平（德国 Sartorius 公司）；

KQ3200DE超声仪（江苏昆山舒美公司）。色谱纯乙腈（美国 Sigma 公司），分析纯甲醇、磷酸（国药集团试剂公司），液相用双蒸水（自制），

0.22 µm微孔滤膜（安捷伦公司）。消瘀接骨散样品（安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供），批号分别为 141227、150219、150520、150828、151107、

160108、160312、160615、160904、1611009，依次编号为S1～S10。对照品来源信息见表1。 2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱

（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），流动相为乙腈-0.1%磷

酸水溶液，梯度洗脱（0～2 min，3%～15%乙腈；2～

6 min，15%～25%乙腈；6～15 min，25%～75%乙腈；

15～16 min，100%乙腈；16～18 min，100%乙腈；18～

19 min，100%～3%乙腈；19～22 min，3%乙腈），检测波长 220 nm，流速 0.2 mL/min，柱温 30 ℃，进样量 1 µL [6]。

2.2 对照品溶液的制备精密称定原儿茶酸 3.76 mg、阿魏酸 2.32 mg、桂皮醛 8.94 mg、丁香酚 123.77 mg、胡椒碱 2.52 mg、欧前胡素 3.61 mg，置于 10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。依次精密吸取上述对照品溶液各一定量，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成终浓度为原儿茶酸 1.41 µg/mL、阿魏酸

6.22 µg/mL、桂皮醛 52.94 µg/mL、丁香酚 61.62 µg/mL、胡椒碱 126.12 µg/mL 和欧前胡素 7.11 µg/mL 的混合对照品溶液，冷藏备用。

2.3 供试品溶液的制备取各批消瘀接骨散约0.4 g，精密称定，置棕色容量瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率 300 W，频率 40 kHz）30 min，冷却，再次称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密吸取S5 号样品1 份，按“2.3”项下方法操

作，采用“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录指纹图谱，将得到的色谱图处理成AIA格式后导入《中

药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》进行计算，对 17 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，其 RSD 分别为 0.028%～0.45%和 0.306%～

2.98%。6 份指纹图谱的相似度均为1.00。结果表明，该仪器精密度较好。

2.4.2 重复性试验

称取 S8 号样品6份，精密称定，按“2.3”项下

方法制备供试品溶液，采用“2.1”项下色谱条件检测，进样量为1 µL，记录色谱图，将获得的6份样品色谱图处理成 AIA格式后导入《中药色谱指纹图谱相似度

评价系统（2004A）》进行计算，17 个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为 0.015%～

0.195%和 0.230%～2.708%。结果表明，建立的样品处理方法重复性较好。

2.4.3 稳定性试验

取 S4号样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶

液，按“2.1”项下色谱条件，分别于制备后0、4、8、

12、16、24 h各进样1次，进样量1 µL，记录色谱图，

并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》

进行计算，17个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰

面积的 RSD 分别为 0.028%～1.078%和 0.468%～

2.873%，6 次进样的相似度均为1.00。结果表明，样品溶液在 24 h内较为稳定。

2.4.4 数据处理采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似

度评价系统（2004A）》进行数据匹配处理和相似度分

析[7]，采用 SPSS20.0 统计软件进行聚类分析和PCA。

2.5 指纹图谱的建立及相似度分析

2.5.1 参照峰的确定

10批消瘀接骨散样品的指纹图谱中，丁香酚的色谱峰分离度较好，出峰时间位于色谱图的中间时间段，且峰面积最大，故选择丁香酚为参照峰。

2.5.2相似度评价

取 10 个批次的消瘀接骨散样品，精密称定，按

“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件各进样1 µL，获取 10批样品的指纹图谱。将

10批消瘀接骨散样品色谱峰数据导入《中药色谱指纹

图谱相似度评价系统软件（2004A）》，进行叠加，得到 10批样品的指纹图谱叠加图。以S1号样品图谱作为参照谱，选用中位数法，时间宽度定为0.1 min，进

行色谱峰匹配，并计算相似度[8-10]。共自动匹配了 17个共有色谱峰，结果见图 1；计算各共有峰的相对峰面积及其RSD，结果见表 2；10批消瘀接骨散样品的相似度介于 0.969～0.998，结果见表 3。

2.5.4聚类分析

为了解 10 批消瘀接骨散的质量差异情况，本试验对所获得的 10 批样品指纹图谱数据进行进一步分析。以指纹图谱中 17 个共有色谱峰面积为数据源，采用 SPSS20.0 软件，进行系统聚类分析。分析方法选用组间平均数联结模式，采用夹角余弦法计算样品相似度距离，得出 10 批消瘀接骨散样品系统聚类树

状图[11-12]，结果见图 3。可以看出，10批消瘀接骨散样品大致可聚为2大类，Ⅰ类包括除S8 和 S9 号样品之外的 8 批样品，质量较接近；Ⅱ类是 S8 和 S9 离Ⅰ类的8个样品相对较远，与其他8批样品有一定差异，其相似度也较低。以 17 个共有峰峰面积为指标进行聚类分析，结果表明不同批次消瘀接骨散的质量较为接近。

2.5.3色谱峰指认

将 10 批消瘀接骨散样品生成的 UPLC 对照指纹图谱，与混合对照品色谱图进行比对，通过对照保留时间，指认了其中的6个色谱峰，分别为2号峰（原

儿茶酸）、7 号峰（阿魏酸）、10 号峰（桂皮醛）、11

号峰（丁香酚）、12 号峰（胡椒碱）、15 号峰（欧前胡素），见图2。 2.5.5 主成分分析

PCA 是将多个变量信息通过线性变换集中到较少个数综合指标即所谓主要成分上的多元统计分析方法，其主要利用主要成分提取数据集的特征，采用

的是数学上处理降维方法[13]。本研究采用 SPSS22.0软件对液相分析所获得的 17 个共有色谱峰进行 PCA计算。结果显示，本批数据的前5个主成分的累计贡献可以达到91.526%，已包含了本批数据中的大部分信息。各主成分的特征值和方差贡献率分别为：第一主成分 8.715、51.266%；第二主成分 2.808、16.517%；第三主成分 1.548、9.108% ；第四主成分 1.372、

8.070%；第五主成分 1.116、6.565%。以第一、二、三主成分建立其坐标系，进行投影作图，得到 10 批样本的三维主成分立体投影图（见图 4）。可见，17个共有峰大致可分为3 类[14]。

对主成分载荷矩阵中的数据进行统计和计算，得到各主成分的模型公式：

A1＝0.052F1＋0.137F2＋0.052F3＋0.187F4－0.094F5－

0.056F6＋0.145F7＋0.027F8＋0.194F9＋0.220F10－

0.008F11－0.182F12＋0.083F13－0.020F14＋

0.136F15＋0.296F16－0.038F17

A2＝0.002F1＋0.023F2＋0.166F3－0.067F4＋0.245F5＋

0.213F6＋0.018F7＋0.151F8＋0.249F9－0.240F10－

0.043F11－0.016F12－0.017F13－0.019F14－

0.127F15－0.103F16＋0.190F17

A3＝0.039F1－0.082F2－0.163F3－0.056F4＋0.011F5－

0.011F6－0.025F7＋0.073F8－0.050F9－0.13F10＋

0.027F11＋0.583F12＋0.294F13－0.061F14＋

0.291F15－0.158F16－0.072F17

A4＝0.261F1＋0.019F2＋0.012F3＋0.094F4＋0.025F5＋

0.063F6＋0.011F7－0.339F8－0.112F9－0.282F10＋

0.121F11＋0.074F12－0.198F13＋0.588F14－

0.156F15－0.110F16＋0.084F17

A5＝-0.113F1－0.211F2＋0.214F3＋0.166F4－0.067F5－

0.192F6＋0.003F7＋0.125F8＋0.097F9－0.025F10＋

0.637F11＋0.053F12＋0.088F13＋0.175F14－

0.188F15＋0.110F16－0.103F17

A1～A5 分别为前 5 个主成分，F1～F17 分别表示各色谱峰峰面积经过标准化处理后的数据。在所获得的前 5个主成分中，以 A1的特征值最大，即判断其为“信息量”最多的色谱峰，其对指标成分的贡献率也最大。以此类推，变量排在前5名的系数所对应的色谱峰序号分别是 16、4、9、7、2 号峰。在与混合对照品图谱对照后可知，其中的2号峰为原儿茶酸，

7 号峰为阿魏酸。4、9、16号峰为未知成分，需要进一步分析确证。

讨论为了更全面反映消瘀接骨散制剂中的成分，本研究在不同检测波长条件下对消瘀接骨散样品进行了扫描和比较。结果当检测波长为220 nm时，所得制剂指纹图谱中各成分的指纹峰分离度良好，故最终选择 220 nm作为测定波长。此外，本试验对不同提取溶剂（水及 70%、80%、95%、100%乙醇、甲醇）的提取效率进行了比较，结果以 100%甲醇超声提取得到的供试品溶液中各成分含量相对较高，液相色谱检测所出的色谱峰数较多，故最终选定甲醇为样品的提取溶剂。

本试验对 10 批消瘀接骨散样品进行了 UPLC 指纹图谱研究，并使用相似度分析、聚类分析及 PCA 化学模式识别对所得数据进行分析处理。结果 10 批消瘀接骨散样品的指纹图谱相似度均在0.94 以上，说明制剂总体质量较为稳定，但其中 S9 号样品的相似度相对较低，可能与该批制剂的原料药材质量相关。此外，对 10批样品指纹图谱中的17个共有色谱峰进行了归属，通过与已知的混合对照品比较，指认了其中 6种成分；由相似度分析结果可以初步了解不同批次消瘀接骨散制剂的质量；通过聚类分析，可将 10批样品大致聚成2类，其结果与相似度分析结果可相互印证，总体趋势较接近；PCA可将反映消瘀接骨散指纹图谱的多维特征参数归纳为5个主成分来描述，得出影响消瘀接骨散指纹图谱差异的主要色谱峰[15]。本研究建立的UPLC指纹图谱和相关结果分析可作为消瘀接骨散质量控制的参考。

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（收稿日期：2017-12-04）

（修回日期：2018-01-04；编辑：陈静）