HPLC同时测定镇脑宁胶囊中4种成分含量

谭霖1，杜丰2，王祥培2，晏树吉 2

1.黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000；2.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550000摘要：目的 建立 HPLC 同时测定镇脑宁胶囊中葛根素、阿魏酸、欧前胡素、丹参酮ⅡA 共 4 种有效成分含量的方法。方法 采用 Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为 220 nm，柱温为 25 ℃。结果 4种成分的线性范围分别为：葛根素 4.96～496.00 µg（r＝1.000 0），阿魏酸 2.05～205.00 µg（r＝1.000 0），欧前胡素 1.99～199.00 µg（r＝0.999 3），丹参酮ⅡA 2.11～211.00 µg（r＝0.999 9）；加样回收率为 99.1%～113.1%，RSD 为 0.6%～1.8%；4 种成分的样品含量分别为：葛根素 3.866～4.729 mg/g，阿魏酸 0.286～0.315 mg/g，欧前胡素 0.367～0.490 mg/g，丹参酮ⅡA

0.293～0.409 mg/g。结论 该方法可同时测定镇脑宁胶囊中4种成分的含量，操作便捷，重复性好。关键词：镇脑宁胶囊；葛根素；阿魏酸；欧前胡素；丹参酮ⅡA；含量测定；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.08.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)08-0090-04

Simultaneous Determination of Four Components in Zhennaoning Capsules by HPLC

TAN Lin1, DU Feng2, WANG Xiang-pei2, YAN Shu-ji2

1. Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing Center, Kaili 556000, China;

2. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, China

Abstract: Objective To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of four active components of puerarin, ferulic acid, imperatorin and tanshinoneⅡA in Zhennaoning Capsules. Methods The mobile phase was eluted with Diamonsil C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) by using methanol-0.1% phosphoric acid as mobile phase with a flow rate of 1.0 mL/min and a detection wavelength of 220 nm. The column temperature was

25 ℃. Results The linear range of four components was: puerarin, 4.96–496.00 µg (r=1.000 0); ferulic acid,

2.05–205.00 µg (r=1.000 0); imperatorin, 1.99–199.00 µg (r=0.999 3); tanshinoneⅡA, 2.11–211.00 µg (r=0.999 9). The recoveries of samples were 99.1%–113.1% , and RSD were 0.6%–1.8%. The contents of four components were as follows: puerarin, 3.866–4.729 mg/g, ferulic acid, 0.286–0.315 mg/g, imperatorin 0.367–0.490 mg/g, tanshinone ⅡA,

0.293–0.409 mg/g. Conclusion The method can be used for the determination of four components in Zhennaoning Capsules, with simple and convenient operation and good repeatability.

Keywords: Zhennaoning Capsule; puerarin; ferulic acid; imperatorin; tanshinone ⅡA; content determination; HPLC

镇脑宁胶囊由猪脑粉、丹参、川芎、葛根、白芷、细辛、水牛角浓缩粉、天麻、藁本组成，具有熄风通络功效，用于风邪上扰所致的头痛头晕、恶心呕吐、视物不清、肢体麻木、耳鸣，以及血管神经性头痛、

高血压、高血脂和动脉硬化症、顽固性失眠等[1]。有报道采用薄层鉴别方法定性检测镇脑宁胶囊中的成分，或采用 HPLC分别测定天麻素、丹参酮ⅡA等成

分含量[2-5]，2015 年版《中华人民共和国药典》（一部）采用HPLC分别测定镇脑宁胶囊中葛根素、丹参酮ⅡA 通讯作者：王祥培，E-mail：709521748@qq.com 和丹酚酸B 的含量[1]，未见采用 HPLC同时测定镇脑宁胶囊中葛根素、阿魏酸、丹参酮ⅡA及欧前胡素 4种成分含量的研究报道，不利于全面、快捷分析镇脑宁胶囊中的成分及其含量。为保证镇脑宁胶囊质量研究的全面性和便利性，本研究采用HPLC同时测定镇脑宁胶囊中葛根素、阿魏酸、丹参酮ⅡA及欧前胡素的含量，为镇脑宁胶囊的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括 G1311C 脱气机、G1329D自动进样系统、G1316A 柱温箱、G1315D 二极管阵列检测器等），

Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），

KQ-500DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有

限公司），AE240 电子分析天平（Mettler Toledo）。对照品葛根素（批号 110752-201313 ，含量

95.5%）、阿魏酸（批号 110773-201313，含量 99.6%）、欧前胡素（批号 110826-201214，含量 99.5%）、丹参酮ⅡA（批号 11706-200619，含量 100%），中国食品药品检定研究院。镇脑宁胶囊，规格 0.3 g/粒，通化东宝药业股份有限公司，批号 150703、170105、

170602。甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；

流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱

（0～10 min，10%A；10～20 min，10%→20%A；20～

40 min，20%→30%A；40～50 min，30%→70%A；

50～60 min，70%A；60～70 min，70%→80%A；70～

85 min，80%→90%A）；流速：1.0 mL/min；检测波

长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：对照品10 µL，供试品和阴性对照各20 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备取葛根素、阿魏酸、欧前胡素、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每 1 mL分别含葛根素 0.992 mg、阿魏酸 0.410 mg、欧前胡素

0.398 mg、丹参酮ⅡA 0.422 mg的混合对照品贮备液。精密量取混合对照品贮备液1 mL，置 20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每 1 mL 含葛根素

49.6 µg、阿魏酸20.5 µg、欧前胡素19.9 µg、丹参酮ⅡA

21.1 µg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物10粒，混匀，取约 0.5 g，精密称定，置 50 mL量瓶中，加入甲醇45 mL，超声处理（功率 250 W，频率 100 kHz）40 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用 0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按镇脑宁胶囊处方比例[6]分别制备缺葛根阴性样品、缺丹参阴性样品、缺白芷阴性样品、缺川芎和藁

本阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验分别吸取混合对照品溶液10 µL，供试品溶液、阴性对照溶液各20 µL，在“2.1”项色谱条件下，注入 HPLC色谱仪，记录色谱图。在上述色谱条件下， 供试品溶液与对照品溶液对应的吸收峰理论塔板数均大于 5000，对应色谱峰的分离度均大于 1.5，阴性对照溶液显示镇脑宁胶囊中其他成分对4种分析物的测定无干扰。色谱图见图1。

2

2.4线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品贮备液 0.1、

0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置 20 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密吸取上述溶液10 µL注入液相色谱仪，记录峰面积。以对照品进样量（µg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好，见表1。 2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次进行测定，记录色谱图，结果葛根素、阿魏酸、欧前胡素和丹参酮ⅡA的峰面积 RSD 分别为 0.23%、0.18%、0.54%、0.83%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验取镇脑宁胶囊样品（批号 170105），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样20 µL，测定峰面积，所得葛根素、阿魏酸、欧前胡素、丹参酮ⅡA平均含量分别为 3.866、

0.315、0.367、0.372 mg/g，RSD 分别为 0.5%、1.8%、

0.7%、0.8%，表明方法的重复性较好。

2.7 稳定性试验取同一供试品溶液，在常温条件下，分别于制备后 0、2、4、6、8、12、24 h，在“2.1”项色谱条件下进样测定4个化合物的峰面积，所得葛根素、阿魏酸、欧前胡素、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.7%、

2.0%、1.4%、1.7%，表明供试品溶液在常温条件下

24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含量样品约0.25 g，共 6份，平均分为3组，按所称取样品中各成分含量的80%、100%、

120%分别加入各对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备，进样20 µL进行测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.9 样品含量测定

取 3 个批号样品，按“2.2.2 项下方法制备供试品

溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算样品中4种成分的含量，结果见表3。

化学稳定性[7-10]，本试验选择超声提取法进行提取，无需加热，避免对热不稳定性成分的影响，且设备简单、操作方便、节约成本、提取效率高，并对不同浓度的甲醇、乙醇进行提取溶剂的考察，结果在相同超声条件下，甲醇提取效果较好，故以甲醇为溶剂进行超声提取。

取同一批号样品，以甲醇为提取溶剂，分别超声提取 20、30、40、60 min，结果 40 min 与 60 min 提取结果基本一致，故采用超声提取40 min。

本试验比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸、

甲醇-0.1%磷酸等流动相，其中以乙腈-水作为流动相

很难使各峰分开，用甲醇-0.1%磷酸溶液则峰分离度较好，故选择为流动相，并采用梯度洗脱法，将待测成分与杂质峰完全分离，有较好的峰形和较高的理论塔板数，效果好。

经紫外分光光度仪扫描可知，葛根素、阿魏酸、欧前胡素和丹参酮ⅡA在波长 220、230 nm处均有良好的紫外吸收，且经HPLC 考察了 220、230、240、

250、260、270、280、290 nm，各成分色谱峰在 220 nm波长处峰形和分离度较好，故采用220 nm作为测定波长。

本研究建立了HPLC同时测定镇脑宁胶囊中丹参酮ⅡA、葛根素、阿魏酸、欧前胡素 4 种有效成分含量的方法，可对该制剂的质量进行较为系统全面的控制，且操作简便，溶剂及流动相选用经济，方法回收率高，重复性好。本研究可为镇脑宁胶囊制剂、原药材及中间品的质量控制标准的建立提供参考。

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（收稿日期：2018-04-11）

（修回日期：2018-04-25；编辑：陈静）