益气活血消癥方对良性前列腺增生大鼠细胞凋亡的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 目次 -

袁轶峰1,傅显文2,朱文雄1,刘涛1,周兴 1,杨晶2,贺菊乔 1

1.湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;2.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208摘要:目的 观察益气活血消癥方对良性前列腺增生大鼠细胞凋亡的影响,初步探讨其作用机制。方法 将

60 只 8周龄雄性SD大鼠随机分为正常组、阳性对照组和消癥方低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠均予去势加丙酸睾酮注射法复制前列腺增生模型。正常组和模型组大鼠予生理盐水灌胃,消癥方低、中、高剂量组大鼠分别予益气活血消癥方10、20、40 mg/100 g灌胃,阳性对照组大鼠予癃开颗粒混悬液

11 mg/100 g 灌胃,1 次/d,连续 30 d。末次给药 24 h后,脱颈处死大鼠,取前列腺组织,免疫组化检测大鼠前列腺组织 Bcl-2、Bax 蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠前列腺组织 Bax 表达显著降低,Bcl-2表达显著升高;与模型组比较,各给药组大鼠前列腺组织Bax 表达显著升高,Bcl-2表达显著降低,且消癥方高剂量组效果最优。结论 益气活血消癥方可促进大鼠前列腺组织细胞凋亡,其机制与前列腺组织 Bax 蛋白

表达升高、Bcl-2蛋白表达降低相关,从而改善良性前列腺增生。

关键词:益气活血消癥方;良性前列腺增生;细胞凋亡;Bax;Bcl-2;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.013

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)09-0052-04

Effects of Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula on Apoptosis of Rats with Benign Prostatic Hyperplasia

YUAN Yi-feng1, FU Xian-wen2, ZHU Wen-xiong1, LIU Tao1, ZHOU Xing1, YANG Jing2, HE Ju-qiao1

1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China;

2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Objective To investigate the effects of Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula on cell apoptosis in rats with benign prostatic hyperplasia (BPH); To preliminarily explore its mechanism of action. Methods Totally sixty

8-week-old male SD rats were randomly devided into normal group, positive control group, Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula low-, medium-, and high-dose groups, with 10 rats in each group. Except for the rats in normal group, rats in other groups were treated with castrate and testosterone propionate injection to replicate BPH model. The normal group and the model group were given normal saline for gavage; Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula low-, middle-, and high-dose groups were given Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula 10, 20, 40 mg/100 g for gavage, respectively; rats in positive control group were given Longkai Granule suspension 11 mg/100 g for gavage, once a day, for 30 d. Twenty-four hours after the last administration, the rats were sacrificed by cervical dislocation. The prostate tissue was taken. The protein expressions of Bcl-2 and Bax in the prostate tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normol group, the expression of Bax in the prostate tissue of the model group decreased significantly, while the expression of Bcl-2 increased significantly; Compared with the model group, the expression of Bax in the prostate tissue of rats in administration groups increased significantly, while the expression of Bcl-2 was significantly reduced, and Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula high-dose group was superior to other groups. Conclusion Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula can improve benign prostatic hyperplasia by promoting the apoptosis of rat prostate tissue, and its mechanism is related to the increase of the expression of Bax protein and the decrease of

Bcl-2 protein expression in prostate tissue.

Keywords: Yiqi Huoxue Xiaozheng Formula; benign prostatic hyperplasia; apoptosis; Bax; Bcl-2; rats

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81673984);湖南省技术创新引导计划临床医疗技术创新引导项目(2017SK50305);

湖南省中医药科研计划项目(201832);全国名老中医药专家传承工作室建设项目(2014年)

通讯作者:杨晶,E-mail:39767485@qq.com

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)是男科的常见病,以尿频、夜尿次数增多、排尿困难为主要临床表现,控制不佳者,可并发尿潴留

或尿失禁,甚至肾功能受损等疾患[1]。目前对于BPH的发病机制尚未定论,其治疗方式以观察等待、药物

保守治疗及外科手术为主[2]。临床常用治疗药物包括

5α-还原酶抑制剂、激素、α受体阻滞剂等,因这些药物的不良反应及耐药性,使其临床应用受到限制;而手术治疗虽可切除增生的前列腺组织,但也存在风险

大、远期疗效不佳等问题[3]。大量临床研究表明,中医药治疗 BPH 有一定的优势,可明显改善症状[4-7]。益气活血消癥方为贺菊乔教授临床治疗 BPH 的经验方,本实验观察其对 BPH 大鼠细胞凋亡的影响,从分子水平初步探讨其抗BPH的作用机制。1 实验材料

1.1 动物

8周龄雄性SD 大鼠 60 只,SPF 级,体质量 250~

300 g,湖南中医药大学动物实验中心,动物合格证号湘医动字第 20-002 号。饲养于温度 15~18 ℃、湿度

70%环境,自由摄食饮水。

1.2 药物益气活血消癥方(黄芪30 g、白术 15 g、炮山甲

6 g、三棱 6 g、蒲黄 10 g、五灵脂 10 g、枳实 15 g、鳖甲 10 g等),所有饮片由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供,配制成10 mg/mL 汤剂。癃开颗粒,

上海雷允上药业有限公司,7 g/袋,批号 20170613,临用时以生理盐水配成混悬液。

1.3 主要试剂与仪器多聚甲醛,天津市化学试剂研究所;丙酸睾酮注射液,上海第九制药厂;多聚丙酮,仙桃市第一化工厂;无水乙醇、磷酸盐缓冲液(PBS)、医用过氧化氢、二甲苯,长沙的波化学试剂厂;中性树胶,上海标本

模型厂;Bcl-2、Bax检测试剂盒,武汉博士德公司。MIAS 图形图像分析系统(Professional Series,厦门),透射电镜(日本 JEOL 公司),石蜡切片机(英国山姆公司),双目显微镜(德国莱卡),微波炉(上海三菱电机微波炉电器有限公司),电子天平及电热恒温

培养箱(上海精密科学仪器有限公司),AB204-S 分

析天平(台湾华科电子仪器有限公司),MP530 照相机(德国莱卡),超低温冰箱(日本三洋公司),电热恒温水箱(上海市南阳仪器有限公司)。2 实验方法

2.1 分组及造模实验大鼠适应性饲养1周,随机分为正常组、模 型组、阳性对照组和消癥方低、中、高剂量组。除正常组外,其余大鼠均予去势加丙酸睾酮注射法复制BPH模型。先去毛,皮肤局部消毒,麻醉(水合氯醛

3.5 mg/kg)、摘除双侧睾丸。正常组仅麻醉后切开腹腔,游离但不摘除双侧睾丸,结扎止血后常规缝合。术后每只大鼠肌注青霉素 20 万 U,待大鼠清醒后观察其生命体征。各组造模大鼠从摘除睾丸后第8日开始背部皮下注射丙酸睾酮5 mg/kg[8-10]。

2.2 给药根据体表面积折算,癃开颗粒、益气活血消癥方大鼠临床给药剂量分别为11 mg/100 g、10 mg/100 g。注射丙酸睾酮同时,消癥方低、中、高剂量组予低、中、高浓度益气活血消癥方灌胃,分别为临床给药剂量的 1、2、4倍,阳性对照组予癃开颗粒混悬液常规剂量灌胃,正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积1 mL/100 g,每日 1次,连续30 d。每周称重

1次,根据体质量调整用药剂量。末次给药24 h后,脱颈处死大鼠,取前列腺组织。

2.3 Bcl-2、Bax 蛋白表达检测将前列腺组织置于多聚甲醛溶液,脱水,石蜡包埋、切片,按照试剂盒说明操作,滴加一抗后 PBS清洗,再滴加二抗。DAB 显色,苏木精复染,光学树脂胶封固,MIAS 图形图像系统分析。每张切片随机选取5个视野(×400),计算阳性细胞总面积、积分光密度。

3 统计学方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示。计量资料采用 t 检验,多组间比较采用方差分析,方差齐用LSD法,方差不齐用KW-H 检验。

P<0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

Bcl-2、Bax 蛋白在正常前列腺组织中无阳性表达或较少表达,阳性表达位于腺上皮细胞胞浆,呈棕黄

色。正常组大鼠前列腺组织基本无阳性颗粒,Bcl-2、Bax 不表达;模型组大鼠前列腺组织 Bcl-2 阳性颗粒增加,Bax阳性颗粒减少;消癥方各剂量组和阳性对照组大鼠 Bcl-2 阳性颗粒灰度逐渐变暗,Bax 阳性颗粒灰度逐渐变亮,均以消癥方高剂量组效果最明显。见图 1、图 2。与正常组比较,模型组大鼠前列腺组织 Bcl-2 表达显著升高,Bax 表达显著降低,差异有

统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠前列腺组织 Bcl-2 表达显著降低,Bax 表达显著升

高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且消癥方高剂量组效果最优。见表1、表 2。

5 讨论

BPH常见于中老年人,受多种因素影响。老年时期,某些因素的影响使机体调控机制失衡。平衡机制包括两个方面:一是由细胞周期调控的细胞增殖,二是由凋亡调节的细胞死亡。细胞凋亡减少或细胞增殖,均可导致前列腺细胞堆积而形成前列腺增生。目前,将细胞凋亡相关基因根据功能大致分为3大类:

凋亡抑制基因(Bcl-2、IAP、EIB)、凋亡促进基因(Bax、

Fas、ICE、p53)及双向凋亡基因(c-myc、Bcl-x)。其中 Bcl-2 与 Bax被认为是参与前列腺组织细胞凋亡

过程最重要的调节基因。Bcl-2 为凋亡抑制基因,可通过增加双氢睾酮或调节生长因子,使前列腺组织上皮细胞增生,腺腔变大,分泌物增多。Bax为凋亡促 进基因,可抑制上皮细胞的增殖,而在BPH形成时,该基因的抑制作用则表达不明显或不表达。通过调整两者的比例可发挥抑制前列腺上皮增生的作用,从而改善前列腺组织的增生。

中医学无BPH的病名,一般将其归属于“癃闭”范畴。贺教授根据 40 余年的临证经验提出,BPH 应属“癥瘕”,发病基础为排尿无力、尿不尽、射程较短。BPH发病人群多为老年人,年老体弱、阳气不足,气虚则无力推动血液运行,久则成瘀;瘀血进一步阻滞气机,形成恶性循环。临床上,肛门指检常可触及增大的前列腺组织并有压痛,B超可见腺体增生,望诊常见舌质紫黯或有瘀斑、瘀点,脉象诊之为涩脉等,皆可证实气虚血瘀是 BPH 的重要病理基础。清·王

清任指出:“癥瘕积聚,压迫膀胱水道,则发为闭癃。”强调癥瘕的形成皆与瘀血有关。《灵枢•天年》云:“六十岁,心气始衰……血气懈惰,故好卧。”七情内伤,肝失疏泄,气郁阻滞,血行不畅致血瘀;或因过度忍精不泄,败精阻于内,血脉不通;或因肾元亏虚,温煦推动气血运行失职而致瘀。膀胱精室为瘀血所阻,膀胱气化不利,水道不通,最终导致气滞、血瘀、水停,三者共同促使癥瘕形成。可见,癥瘕之形成归根于气血运行失调。气虚、气滞皆致血运受阻,瘀血内阻日久而成癥瘕。因此,调气和血、化瘀消癥为治疗癥瘕的基本方法。癥积得散,水道自通,则癃闭亦愈。

益气活血消癥方具有益气活血、消癥止痛的功效。方中黄芪益气利水,气化则水行,小便得通。徐

薇等[11]研究表明,黄芪对前列腺增生大鼠有减轻前列腺湿重及逆转前列腺增生的作用。古代医家认为,“正气内存、邪不外干”“邪之所凑,其气必虚”。穿山甲、蒲黄、三棱配伍具有活血化瘀兼利尿通淋之功,黄芪、白术与三药配伍标本兼顾,活血通淋不伤正,扶正不敛邪。五灵脂有活血止痛之效。气血瘀滞,气机运行不畅,加重局部疼痛,因此,方中加用枳实以行气消癥止痛。“气为血之帅,血为气之母”,补气时若不辅以滋阴养血,补气必定达不到效果,且大量使用通淋药物,必伤阴液,故加用鳖甲以养阴。

本实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠前列腺组织 Bax 表达显著降低,Bcl-2 表达显著升高;与模型组比较,各给药组大鼠前列腺组织Bax 表达显

著升高,Bcl-2 表达显著降低,消癥方高剂量组效果最优。

综上,益气活血消癥方通过降低前列腺组织

Bcl-2 的表达及升高 Bax 的表达,促进前列腺组织细胞凋亡,抑制上皮细胞增殖,从而达到治疗前列腺增 生的效果,为临床运用益气活血消癥方治疗 BPH 提供依据。

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(收稿日期:2018-04-09)

(修回日期:2018-05-14;编辑:华强)

正常组 正常组 模型组 模型组 消癥方低剂量组 消癥方低剂量组 消癥方中剂量组 消癥方中剂量组 消癥方高剂量组 消癥方高剂量组 阳性对照组 阳性对照组

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