一测多评法测定复方白芷止痛胶囊中4种指标成分

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 目次 -

黄广伟,杨素德,曹婧迪上海绿谷生命园医药有限公司,上海复方中药(绿谷)工程技术研究中心,上海 201707摘要:目的 以欧前胡素为内标物,建立测定复方白芷止痛胶囊中阿魏酸、绿原酸、异欧前胡素多种指标性成分含量的一测多评方法。方法 采用HPLC,色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD(4.6 mm×250 mm,5 µm),

以乙腈-0.2%甲酸为流动相,梯度洗脱,柱温30 ℃,检测波长分别为320 nm(绿原酸、阿魏酸)和 300 nm(欧前胡素、异欧前胡素),流速为1 mL/min进行测定。以欧前胡素为内标物,建立复方白芷止痛胶囊中阿魏酸、绿原酸、异欧前胡素的相对校正因子。结果 复方白芷止痛胶囊中阿魏酸、绿原酸、异欧前胡素的相对校正因子重现性良好,分别为1.16、2.00、1.00,一测多评法测定结果与外标法比较无显著差异。结论 以欧前胡素为内标物建立复方白芷止痛胶囊多种指标性成分的一测多评法结果准确性良好,方法可行,可作为复方白芷止痛胶囊的质量控制方法。关键词:复方白芷止痛胶囊;一测多评法;阿魏酸;绿原酸;欧前胡素;异欧前胡素

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.021

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)09-0086-05

Content Determination of Four Index Components in Compound Baizhi Zhitong Capsules by QAMS Method

HUANG Guang-wei, YANG Su-de, CAO Jing-di

Shanghai Green-valley Shengmingyuan Pharmaceutical Co., LTD, Shanghai Compound Traditional Chinese

Medicine (Green Valley) Engineering Technology Research Center, Shanghai 201707, China

Abstract: Objective To develop a new method for content determination of chlorogenic acid, ferulic acid, and isoimperatorin in Compound Baizhi Zhitong Capsules through quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) method by setting imperatorin as internal standard substance. Methods HPLC was adopted. The chromatographic column of Thermo Hypersil GOLD (4.6 mm×250 mm, 5 µm) was used; the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.2% formic acid in gradient elution; the flow speed was 1 mL/min; the detection wavelength were 320 nm (chlorogenic acid, ferulic acid) and 300 nm (imperatorin and isoimperatorin). The relative analysis correction factors of imperatorin to other three components were established by setting imperatorin as internal standard substance. Results The relative analysis correction factors of chlorogenic acid, ferulic acid, and isoimperatorin in Compound Baizhi Zhitong Capsules were 1.16, 2.00, and 1.00, which had a high reproducibility. There was no significant difference between QAMS and external standard method. Conclusion The QAMS method for Compound Baizhi Zhitong Capsules by setting imperatorin as internal standard substance is accurate and feasible, which can be used as a useful quality control method for Compound Baizhi Zhitong Capsules.

Keywords: Compound Baizhi Zhitong Capsules; quantitative analysis of multi-components by single-marker; chlorogenic acid; ferulic acid; imperatorin; isoimperatorin

复方白芷止痛胶囊为王永炎院士的临床经验方,由白芷、藳本、天麻3味药组成,临床治疗偏头痛具有良好效果。方中白芷性温、味辛,归胃、大肠、肺经,具有发散风寒、通窍止痛、燥湿止带、消肿排脓等功效,临床常用于治疗阳明头痛、眉棱骨痛、鼻渊头痛、牙痛、风寒湿痹等,其主要含有香豆素类成分、挥发油类、多糖类、甾醇类及生物碱等,香豆素类含 量可达 1%左右[1],其中包括欧前胡素、异欧前胡素

等[2-3]。藁本祛风散寒、除湿止痛,用于风寒感冒、巅顶疼痛、风湿痹痛,其主要含有挥发油类,如洋川

芎内酯类、藁本内酯类等[4-5]。王连国等[6]采用 HPLC测定不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的

含量并进行比较。2015年版《中华人民共和国药典》将阿魏酸作为控制藁本质量的成分。选取单一指标性

成分难以表征具有多样性、复杂性特点的中药制剂的质量,而一测多评法是通过测定1个成分实现以多个

成分同步监控产品质量的有效方法[7-8]。为更好地控制复方白芷止痛胶囊的产品质量,本研究选取阿魏酸、绿原酸、欧前胡素、异欧前胡素为指标成分,以欧前胡素为内标物,采用HPLC建立一测多评法,对制剂中的4种成分进行含量测定,从而保证制剂质量

的可控性[2,9-10]。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪(DAD 检测器),美国 Agilent 公司;KQ-100V 超声波清洗器,昆山市超声波仪器有限公司;Thermo Hypersil GOLD 色谱

柱(4.6 mm×250 mm,5 µm)。对照品阿魏酸(批号 110773-201614 ,含量

99.0%)、绿原酸(批号 110753-201716,含量 99.3%)、欧前胡素(批号 110826-201616,含量 99.6%)、异欧前胡素(批号 110827-201611,含量 99.4%),中国食

品药品检定研究院;复方白芷止痛胶囊(12 粒/板,

0.3 g/粒,批号分别为 170501、170502、170601、

170602、170701、170702、170801、170802、170901、

170902),上海绿谷生命园医药有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯,甲酸为分析纯,纯化水由砾鼎超纯水机制备,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果2.1 色谱条件与系统适用性试验

采用 Thermo Hypersil GOLD 色谱柱(4.6 mm×

250 mm,5 µm);流动相为乙腈-0.2%甲酸,梯度洗脱程序见表1;检测波长:绿原酸、阿魏酸为320 nm,欧前胡素、异欧前胡素为300 nm;流速:1 mL/min;

柱温:30 ℃;进样量:10 µL。阿魏酸、绿原酸、欧前胡素素、异欧前胡素峰的分离度均大于 1.5,拖尾因子介于 0.95~1.05,理论塔板数按各色谱峰计均不少于 5000。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备分别取阿魏酸、绿原酸、欧前胡素、异欧前胡素对照品适量,精密称定,加 50%甲醇制成阿魏酸

258.19 µg/mL、绿原酸 399.58 µg/mL、欧前胡素

490.43 µg/mL、异欧前胡素 160.83 µg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取复方白芷止痛胶囊内容物适量,研细,取0.2 g,精密称定,置25 mL棕色量瓶中,用50%甲醇超声处理(功率 100 kW,频率 40 kHz)10 min 使溶解并稀释至刻度,过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备按处方比例分别制备缺白芷、缺白芷和藁本的阴性样品,按供试品溶液制备方法,同法制备缺白芷的阴性对照溶液及缺白芷和藁本的阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺白芷阴性对照溶液和缺白芷和藁本阴性对照溶液,按

“2.1”项下色谱条件进样分析,结果见图1。

2.3.2 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液,用倍半稀释法稀释成6个不同浓度,按“2.1”项下色谱条件测定,以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程:绿原酸Y=28.763X-8.4743

(r=0.999 8),阿魏酸 Y=49.56X-7.711(r=0.999 8),欧前胡素 Y=24.806X-6.328 2(r=0.999 8),异欧前胡素 Y=24.887X-2.260 8(r=0.999 8)。线性范围分别为:绿原酸 0.0799~0.799 2 µg、阿魏酸 0.051 6~

0.516 4 µg,欧前胡素 0.098 1~0.980 9 µg,异欧前胡素 0.032 2~0.321 7 µg。

2.3.3 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,连续进样6次,测定绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素峰面积,RSD分别为 0.10%、

0.11%、0.05%、0.09%,表明仪器的精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取批号为 170601 的复方白芷止痛胶囊样品,按

“2.2.2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定峰面积,计算含量及其RSD,结果绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素样品含量RSD 分别为 0.82%、0.31%、0.51%、1.26%,表明本方法重复性良好。

2.3.5稳定性试验

取批号为 170601 的复方白芷止痛胶囊样品,按

“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别于 0、2、4、

8、12、16、24 h进样,按“2.1”项下色谱条件测定,结果绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素峰面积RSD 分别为 0.07%、0.08%、0.07%、0.11%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称定复方白芷止痛胶囊样品约0.1 g,平行分成 6 份(100.04、99.96、99.97、99.98、99.98、99.97mg),按 1∶1 比例加入对照品溶液,按“2.2.2”项下方法

制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素峰面积,计算各成分的平均加样回收率及RSD,结果绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素的加样回收率分别为 98.67%、

99.86%、100.04%、101.02%,RSD 分别为 1.60%、

1.96%、1.47%、0.90%。

2.4相对校正因子的确定

3种成分相对校正因子(fk/s)的计算参考《一测多评法建立的技术指南》,以多个质量浓度点计算所

得的 fk/s取平均值作为定量用 fk/s。fk/s=(Cs×Ak)÷ (Ck×As),式中 Cs为内标物质量浓度,As为内标物色谱峰面积,Ck 为其他对照组分质量浓度,Ak 为其

他对照组分色谱峰面积。取“2.2.1”项下混合对照品溶液,分别进样10 µL,测定绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素的峰面积,以欧前胡素为内标物,分别计算 3 种待测成分与欧前胡素之间的 fk/s,最终确定绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素与欧前胡素的 fk/s分别为 1.16、2.00、1.00。

2.5 相对校正因子耐用性考察

2.5.1 不同流速的影响

分别考察不同流速(0.9、1.1 mL/min)对各成分fk/s的影响,结果显示绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素与内标物欧前胡素间的 fk/s 在不同流速条件下重现性良好,RSD分为 0.10%、0.07%、0.04%。

2.5.2 不同柱温的影响

分别考察不同的柱温(28、32 ℃)对各成分 fk/s的影响,结果显示绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素与内标物欧前胡素间的 fk/s 在不同柱温条件下重现性良好,RSD分为 0.34%、0.18%、0.31%。

2.5.3 不同流动相的影响

分别考察 0.3%甲酸、0.1%甲酸、0.05%磷酸对各成分 fk/s 的影响,结果显示绿原酸、阿魏酸、异欧前 3 讨论白芷作为复方白芷止痛胶囊的君药,止痛作用突出,其辛能散,温能祛寒,性燥能除湿,凡风寒湿邪所致气血阻滞而疼痛者均可选用。其作用部位广泛,包括头痛、身痛、脘腹疼痛等,尤其为历代治疗头痛的要药。白芷香豆素为白芷的重要活性物质,具有镇痛作用,欧前胡素为含量相对较高的白芷香豆素之 胡素与内标物欧前胡素间的 fk/s 在不同流动相条件下重现性良好,RSD分为 0.73%、0.38%、0.21%。

2.5.4 不同色谱柱的影响

分别考察 Waters Xbridge Shield RP18 色谱柱

(4.6 mm×250 mm,5 µm)、ZORBAX SB-C18 色谱

柱(4.6 mm×250 mm,5 µm)、Thermo Hypersil GOLD色谱柱对各成分 fk/s的影响,结果显示绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素与内标物欧前胡素间的 fk/s 在不同色谱柱条件下重现性良好,RSD分别为 0.31%、0.52%、

0.66%。

2.6 待测成分色谱峰定位

取“2.3.3”项下混合对照品溶液,分别进样 10 µL,测定绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素与内标物欧前胡素的相对保留时间,结果相对保留时间的 RSD 分别为

0.20%、0.10%、0.01%,表明相对保留时间波动较小,可以作为绿原酸、阿魏酸、异欧前胡素的定位。

2.7 一测多评法与外标法测定结果比较采用外标法测定 10 批复方白芷胶囊样品中绿原酸、阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素4种成分的含量,验证一测多评法计算值的准确性和可靠性,对2种方法测得的数据进行对比分析,结果见表 2。2 种方法

的测定结果差异无统计学意义(P>0.05),表明一测多评法准确性良好,方法可行,结果可靠。 一,欧前胡素在复方白芷止痛胶囊中含量较高,稳定性好,因此,选择欧前胡素为内标物符合一测多评法对内标物的要求。

本试验考察了供试品溶液的制备方法,分别选取超声、振摇考察提取方法,选取5、10、15 min 考察提取时间,选取30%甲醇、70%甲醇考察提取溶剂,结果表明,用 50%甲醇超声处理 10 min 可使样品完

全溶解且所得待测成分含量最大。此外,为使色谱峰对称性更好,选择50%甲醇为提取溶剂。试验中还发现,异欧前胡素与前后杂质峰较难分离,为使分离度合格,本试验考察了流动相种类对异欧前胡素峰的影响,分别选取0.2%甲酸和 0.2%磷酸,结果以 0.2%磷酸为流动相时出现新的杂质峰,分离度未改善,因此选择 0.2%甲酸;改变色谱梯度增加出峰时间,达到有效分离。

本研究通过测定内标物欧前胡素与阿魏酸、绿原酸、异欧前胡素的fk/s,分别考察了不同柱温、流速、流动相及色谱柱对测定结果的影响,结果 RSD 均小于 2%,表明一测多评法建立的 fk/s 耐用性良好。10批样品的一测多评法与外标法测定结果无显著差异,表明本方法准确性良好,方法可行,结果可靠,可作为复方白芷止痛胶囊的质量控制方法。

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(收稿日期:2018-03-09)

(修回日期:2018-03-30;编辑:陈静)

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