基于 Klotho 研究三七总皂苷对大鼠肾缺血-再灌注损伤的保护机制

庄高建，胡鸿运，杨英，唐紫荆，孙轩龙，刘春燕，唐群

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

摘要：目的 观察三七总皂苷对肾缺血-再灌注损伤大鼠Klotho蛋白表达的影响，探讨其对模型大鼠的保护机制。方法 实验大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组和三七总皂苷高、中、低剂量组，各给药组给予相应药物，每日 1 次。建立大鼠肾缺血-再灌注损伤模型，造模 4h 后腹主动脉取血处死大鼠。检测大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）水平及肾组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，HE染色观察肾组织形态变化，免疫组化检测 Klotho、核因子-κB（NF-κB） p65蛋白的表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清 BUN、SCr 水平明显升高（P＜0.05），肾组织 Klotho蛋白表达降低，NF-κB p65蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组 Klotho 蛋白表达升高，NF-κB p65蛋白表达降低（P＜0.05）；与阳性药组比较，三七总皂苷高剂量组 Klotho 蛋白表达升高，NF-κB p65 蛋白表达降低（P＜0.05）。NF-κB p65 蛋白表达与 Klotho 呈负相关（r＝-0.895，P＜0.05）。结论 三七总皂苷可能通过上调 Klotho 蛋白表达，减少 NF-κB p65蛋白表达，抑制氧化应激和对抗炎症，从而发挥保护肾脏作用。关键词：肾缺血-再灌注损伤；氧化应激；Klotho；三七总皂苷；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.008

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)11-0031-05

Study on Protective Mechanism of Panax Notoginseng Saponins on Rats with Renal Ischemia Reperfusion Injury Based on Klotho

ZHUANG Gao-jian, HU Hong-yun, YANG Ying, TANG Zi-jing, SUN Xuan-long, LIU Chun-yan, TANG Qun

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Objective To investigate the effects of Panax Notoginseng saponins (PNS) on protein expression of Klotho in rats with renal ischemia reperfusion injury; To discuss its protective mechanism for model rats.

Methods Experimental rats were randomly divided into sham-operation group, model group, positive medicine group, PNS high-, medium- and low-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine for gavage, once a day. Renal ischemia reperfusion injury model was established. Rats were sacrificed by taking blood from abdominal aorta after 4 hours of modeling. Serum levels of blood urea nitrogen (BUN), creatinine (SCr), malondialdehyde (MDA) content in kidney tissue, superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity were measured. HE staining was used to observe the morphological changes of renal tissue. The protein expressions of Klotho and NF-κB p65 were measured by immunohistochemical method. Results Compared with the sham-operation group, the levels of BUN and SCr in the model group increased significantly (P<0.05); protein expression of Klotho in renal tissue decreased and the protein expression of NF-κB p65 increased (P<0.05). Compared with the model group, the expression of Klotho increased but protein expression of NF-κB p65 decreased in each administration group (P<0.05); Compared with the positive medicine group, the expression of Klotho in PNS

high-dosage group increased but protein expression of NF-κB p65 decreased (P<0.05). The protein expression of NF-κB p65 was negatively related to protein expression of Klotho (r=-0.895, P<0.05). Conclusion PNS can inhibit oxidative stress and anti-inflammatory effects through upregulating protein expression of Klotho, and reduce the protein expression of NF-κB p65, and thus exerts renal protective effects.

Keywords: renal ischemia reperfusion injury; oxidative stress; Klotho; Panax Notoginseng saponins; rats 肾脏血液灌注量较高，对缺血和缺血再灌注敏感性较强。造成缺血性急性肾功能衰竭（ischemic acute renal failure，IARF）的关键环节是肾缺血-再灌注损伤，同时也是肾移植手术中影响肾功能恢复的重要原因。缺血-再灌注损伤和机体内氧化应激及活性氧氧化损伤关系密切[1]。三七总皂苷是三七的主要成分之一，有化瘀止血、抗氧化等药理作用，对缺血性疾病有较好的疗效[2]。本实验复制肾缺血-再灌注损伤大鼠模型，探讨三七总皂苷对模型大鼠的保护机制。

1 材料与方法 1.1 动物

SD雄性大鼠 30 只，SPF 级，体质量 200～220 g，

动物许可证 SCXK（湘）2016-0002，湖南斯莱克景达

实验动物有限公司。饲养于温度 22～25 ℃、相对湿度 50%～60%环境，12 h/12 h昼夜明暗交替，自由摄食饮水。

1.2 药物

三七总皂苷，广西梧州制药（集团）股份有限公

司，批号 17070115；缬沙坦胶囊，北京诺华制药有限

公司，批号X2107，用生理盐水按大鼠体质量配制成

所需剂量的药液。

1.3 主要试剂与仪器

尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（ SOD ）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，南京建成生物工程研究所；Klotho

蛋白、核因子-κB（NF-κB）p65 抗体试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；浓缩型 DAB 试剂盒，北京中杉金桥生物有限公司。数码医学图像分析系统

（Motic6.0），轮转石蜡切片机（德国徕卡 RM2235），生物组织摊片机（金迪 YD-A ），冰箱（青岛海尔

BCD-226SKA），DNP-9162 电热恒温培养箱（上海一

恒），研究型显微镜（MoticBA410），752 型紫外线可见分光光度计（上海恒平）。

1.4 分组及给药

实验大鼠适应性喂养1周后，称重，按体质量编号，再按随机数表法分为假手术组、模型组、阳性药组和三七总皂苷低、中、高剂量组（中药低、中、高剂量组），每组5只。阳性药组给予55 mg/kg 缬沙坦 灌胃，中药低、中、高剂量组给予 40、80、160 mg/kg三七总皂苷灌胃，给药前用生理盐水配成混悬液，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为 10 mL/kg，每日 1次，连续5 d。

1.5 造模

实验大鼠腹腔麻醉，行正中剖腹手术，切除其右侧肾脏组织，游离左侧肾蒂，使用无创性动脉夹，夹闭大鼠左侧肾动脉，造成缺血，45 min 后去掉无创动脉夹恢复肾脏组织血流供应，建立大鼠肾缺血-再灌注损伤模型[3]。供血时观察肾脏颜色，若5 min 后未见肾脏恢复正常鲜红色，则表示造模不成功，30只大鼠均成模。假手术组大鼠只切除右肾，不夹闭左侧肾蒂。造模后4 h腹主动脉取血处死大鼠。

1.6 标本采集及处理

大鼠腹主动脉取血后，3000 r/min 离心 10 min 分离血清，分装后置于-20 ℃冰箱密封保存，用于BUN、SCr检测。分离肾脏周围结缔组织，摘取左侧肾脏，于中上 1/3 横行剖开。上 1/3 肾脏10%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，切片，HE 染色，镜下观察

肾组织形态，免疫组化检测 Klotho 蛋白和 NF-κB p65

的蛋白表达；下 2/3 肾组织置于-80 ℃冰箱保存，用于 MDA、SOD、GSH-Px 检测。

1.7 肾功能及氧化应激指标检测

二乙酰肟显色法测定 BUN，碱性苦味酸比色法测定 SCr，TBA 法测定MDA，羟胺法测定SOD，试剂盒检测 GSH-Px。严格按试剂盒说明书进行操作。

752 型紫外线可见分光光度计测定吸光度，计算BUN、SCr、MDA 含量及 SOD、GSH-Px 活性。

1.8 病理观察

取多聚甲醛固定好的肾组织，常规脱水，组织透

明、浸蜡，包埋，切片（4 μm厚）。切片脱蜡，梯度

乙醇脱水，苏木素染色，1%盐酸乙醇分化1～10 s，

0.5%伊红乙醇溶液中染色2～5 min，再梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察肾脏组织形态。

1.9 免疫组化检测

采用二步法：脱蜡和水化组织切片；新鲜二甲苯

浸泡 10 min×3，无水乙醇浸泡 3 min×3，95%乙醇

浸泡 3 min×3，75%乙醇浸泡 3 min×2，蒸馏水冲洗