六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中苷类成分含量比较研究

张嘉妮 1，2，李玉星 3，杨磊1，肖子曾3，戴冰 1

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湘潭市中心医院，湖南 湘潭 411100；

3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

摘要：目的 建立 HPLC 同时测定六味地黄汤及方中山茱萸-牡丹皮药对莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷、马钱苷含量的方法，探讨全方与该药对主要药效成分之间的关联性。方法 采用 Hypersil C18 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（24∶76），流速 1.0 mL/min，检测波长 236 nm，柱温 30 ℃。结果 莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷分别在 0.480～7.680 µg（r＝0.999 3）、0.103～1.650 µg（r＝0.999 5）、0.120～

1.920 µg（r＝0.999 1）、0.227～3.630 µg（r＝0.999 7）范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.79%、102.29%、100.99%、102.48%，RSD 分别为 1.73%、1.48%、1.32%、0.75%。六味地黄汤中莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷含量略高于山茱萸-牡丹皮药对，马钱苷含量基本相同。结论 本方法简便可靠、重复性好，可用于六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对苷类成分含量测定。山茱萸-牡丹皮药对含有六味地黄汤补肾作用的核心苷类成分。关键词：六味地黄汤；山茱萸-牡丹皮药对；莫诺苷；獐芽菜苷；芍药苷；马钱苷；高效液相色谱法DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.013中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)11-0057-05 Comparative Study on Glycosides Content in Liuwei Dihuang Decoction and Cornus Officinalis - Cortex Moutan Couple ZHANG Jia-ni1,2, LI Yu-xing3, YANG Lei1, XIAO Zi-zeng3, DAI Bing1 1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. Central Hospital of Xiangtan, Xiangtan 411100, China; 3. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Objective To establish an HPLC method for the content determination of morroniside, sweroside, paeoniflorin and loganin of Liuwei Dihuang Decoction and its Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple; To discuss the relationship between the whole prescription and the couple of main pharmacodynamic components. Methods The HPLC method was used at Hypersile C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm); the mobile phase consisted of methanol-water (24:76); the detective wavelength was 236 nm; the flow rate was 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of morroniside, sweroside, paeoniflorin and loganin were among 0.480–7.680 µg

(r=0.999 3), 0.103–1.650 µg (r=0.999 5), 0.120–1.920 µg (r=0.999 1) and 0.227–3.630 µg (r=0.999 7), respectively. The average recovery rates and RSD were 102.79%, 102.29%, 100.99%, 102.48%, and 1.73%, 1.48%, 1.32%, 0.75%, respectively. The contents of morroniside, sweroside and paeoniflorin in Liuwei Dihuang Decoction were slightly higher than that in Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple, and the contents of loganin were almost the same.

Conclusion The method is simple, stable, accurate and reproducible. It can be used for content determinate of glycosides in Liuwei Dihuang Decoction and Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple. Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple has the glycosides with tonifying kidney effect of Liuwei Dihuang Decoction.

Keywords: Liuwei Dihuang Decoction; Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple; morroniside; sweroside; paeoniflorin; loganin; HPLC

基金项目：湖南省中医药科研计划项目重点课题（201802）；湖南省技术创新引导计划临床医疗技术创新引导项目（2017SK50303）；

湖南中医药大学校级科研基金（ZYYDX201806）

通讯作者：戴冰，E-mail：1092341361@qq.com

六味地黄丸由钱乙在《小儿药证直诀》中首创，是金匮肾气丸减桂、附而成，由熟地黄、酒萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓6味药组成，是滋阴补肾的经典方，临床多用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、盗汗遗精、消渴等[1]。六味地黄汤主要含有莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、芍药苷等苷类成分，熊果酸、没食子酸等有机酸类成分，以及丹皮酚等有效成分[2]。根据六味地黄汤相反相成的组方特点，该方可拆成

3 组补泻药对，即熟地黄-泽泻、山茱萸-牡丹皮、山药-茯苓。本课题组前期研究发现，六味地黄汤的3组补泻药对中，仅山茱萸-牡丹皮药对可通过调节神经内分泌系统下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴中各激素水平来改善肾阴虚，可能是该方改善肾阴虚的主要药效组成部分[3-5]，而山茱萸-牡丹皮药对的主要有效成分及其含量、与六味地黄汤全方比较有何区别和联系，还需进一步研究。因此，本研究采用 HPLC 对六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中的苷类成分进行含量测定，建立HPLC同时测定莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷、马钱苷含量的方法，并探究全方与该药对中主要药效成分之间的关联性，为六味地黄汤药效物质基础和组方原理的研究提供依据。

1 仪器与试药Agilent 1100高效液相色谱系统，安捷伦科技（中国）有限公司；Hypersile ODS2 C18色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司）；SK5200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；JY3002 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

莫诺苷对照品（批号 140301）、獐牙菜苷对照品（批号 111742-200501）、芍药苷对照品（批号 110736200731）、马钱苷对照品（批号111640-201005），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；重蒸水（实验室自制）。山药（批号 CS15020203）、熟地黄（批号 CS14120109）、

茯苓（批号JC15051201）、酒萸肉（批号NG14122602）、

牡丹皮（批号 NG15030903 ）、盐泽泻（批号

SH15040701）饮片，湖南中医药大学第一附属医院药 剂科提供。2 方法与结果2.1 色谱条件 Hypersil C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），

流动相为甲醇-水（24∶76），检测波长为 236 nm，流

速 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，进样量10 µL[6]。

2.2 对照品溶液的制备精密称取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品适量，加甲醇分别制成浓度为 960.00 µg/mL 莫诺

苷对照品溶液、206.25 µg/mL獐牙菜苷对照品溶液、

240.00 µg/mL 芍药苷对照品溶液和 453.75 µg/mL 马钱苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液1的制备按六味地黄汤处方中山茱萸-牡丹皮药对比例

（4∶3）称取酒萸肉 12 g、牡丹皮9g，加 6倍量水

浸泡 30 min，煎煮 2次，每次 30 min，合并水煎液，

浓缩至 1.5 g原药材/mL。再精密量取该水煎液2 mL，

加入适量80%甲醇溶液，超声提取（功率200 W，频

率 53 kHz）30 min，过滤，转移至 50 mL容量瓶中，

再用80%甲醇定容至刻度，过 0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，备用。2.4 供试品溶液2的制备按六味地黄汤处方称取熟地黄24 g、酒萸肉12 g、山药 12 g、泽泻 9 g、牡丹皮9g、茯苓9g，加6倍

量水浸泡 30 min，煎煮 2次，每次 30 min，合并水煎

液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取浓缩液5 mL，

按“2.3”项下自“加入适量 80%甲醇溶液”起方法制备，即得。2.5 阴性对照溶液的制备按六味地黄汤处方称取除山茱萸-牡丹皮药对外的其他饮片，加6倍量水浸泡30 min，煎煮 2次，每次 30 min，合并水煎液，浓缩至 1.5 g 原药材/mL。再

精密量取浓缩液5 mL，按“2.3”项下自“加入适量

80%甲醇溶液”起方法制备，即得。2.6 专属性试验取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液 2和阴性对照溶液，

按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果见图1～图 4。

结果表明，供试品溶液 1、2 的色谱图中，在与莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液色谱图在相对应的保留时间处无色谱峰，表明阴性对照无干扰。

2.7 线性关系考察精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液各 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分别置于 5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到不同

浓度梯度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别进样 10 µL，测定峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，得回归方程。

莫诺苷：Y＝5.075 1X＋113.822 0，r＝0.999 3；獐牙

菜苷：Y＝5.481 9X＋42.856 2，r＝0.999 5；芍药苷：

Y＝7.260 2X＋49.248 7，r＝0.999 1；马钱苷：Y＝

5.761 4X＋15.189 2，r＝0.999 7。结果表明，莫诺苷

在 0.480～7.680 µg、獐芽菜苷在 0.103～1.650 µg、芍

药苷在 0.120～1.920 µg、马钱苷在 0.227～3.630 µg 范围内呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对

照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，各连续进样 6次，测定峰面积，计算得RSD 分别为 1.08%、1.19%、

1.18%和 1.01%，结果表明仪器精密度良好。2.9 重复性试验

取同一批山茱萸-牡丹皮药对饮片，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，并计算其含量。结果莫诺苷含量的平均值为 0.776%，RSD＝1.39%；獐牙菜苷含

量的平均值为 0.049%，RSD＝1.95%；芍药苷含量的

平均值为 0.085%，RSD＝1.11%；马钱苷含量的平均

值为 0.353%，RSD＝1.35%。结果表明，本方法重复

性良好。

2.10 稳定性试验取同一供试品溶液，在室温条件下，分别于0、2、

4、8、12、24 h进样，测定莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的峰面积，计算得 RSD 分别为 1.18%、

1.83%、1.14%和 0.93%，结果表明，供试品溶液中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷在24 h内稳定。2.11 加样回收率试验取已知莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量的山茱萸-牡丹皮药对供试品溶液，共 6 份，加入等同于供试品溶液中含量的4 种对照品，按“2.3”项下

方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算平均回收率，结果见表1～表 4。表 1 山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷加样回收率试验

3 讨论本试验分别对莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液进行紫外扫描测定，结果莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷分别在 242、247、230、236 nm波长处有最大吸收。再分别在这4个波长处对样品进行检测，选择基线平稳且所含有效组分指纹峰峰数适中的检测波长。结果发现，在236 nm波长条件下，样品色谱图基线稳定，出峰个数多且峰型较高，故最终确定检测波长为236 nm。

在选择流动相时，参照文献[7-8]和前期研究中的流动相条件加以调整、改进，结果发现，当甲醇与水的比例为 24∶76 时，各色谱峰保留时间适宜，且各成分分离效果较好。虽然莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的出峰时间间隔较短，但山茱萸-牡丹皮药对和六味地黄汤在该流动相条件下各苷类成分色谱峰的分离度均大于 1.5，且阴性对照色谱图中在与上述各成分相对应的保留时间处无干扰，故最终选用甲醇-水（24∶76）作为流动相。

本试验采用 HPLC 测定六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量，该方法简单、快速、重复性好，可为六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对的质量控制提供可靠的检测手段。

现代研究表明，六味地黄汤中苷类成分对 T、B

淋巴细胞有不同程度促增殖作用[9]，对生殖内分泌功

能紊乱及免疫功能下降具有防治作用[10]，对培养的大

鼠成骨细胞有促增殖作用[11]，可改善糖尿病肾阴虚证

大鼠脂代谢[12] ，并可能通过调节2型糖尿病大鼠脂肪

组织 PI3K/Akt 信号通路来干预 2 型糖尿病胰岛素抵抗[13] ；还有研究发现，六味地黄汤对氢化可的松致大鼠肾虚模型的保护作用，其中苷类成分中的獐芽菜苷、马钱苷、莫诺苷为该方补肾作用的核心成分[14]。2015年版《中华人民共和国药典》明确规定，马钱苷、莫诺苷为六味地黄丸含量测定的指标成分[15]，故六味地黄汤中苷类成分是该方补肾药效评价和质量控制的重要指标。本课题组前期研究发现，六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对是该方改善肾阴虚证的主要药效组成部分[3-5]。本研究发现，山茱萸-牡丹皮药对中含有补肾作用的核心苷类成分（莫诺苷 0.780%，獐牙

菜苷 0.050%，芍药苷 0.097%，马钱苷 0.364%）；但与山茱萸-牡丹皮药对比较，六味地黄汤中莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷的含量分别为 0.897%、0.081%、

0.104% ，均略有增加，而马钱苷的含量变化不大

（0.363%）。由此表明，六味地黄汤中除山茱萸-牡丹皮药对外的其他4味饮片，在煎煮过程中可影响该药

对中苷类各成分的煎出量，从而影响六味地黄汤的药效，这可能是六味地黄汤全方补肾作用优于山茱萸牡丹皮药对的原因之一。

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（收稿日期：2017-12-06）

（修回日期：2018-01-14；编辑：陈静） 开放科学（资源服务）标识码（OSID）内含全文PDF和增强文件