当归中混入不同比例独活HPLC特征指纹图谱研究

张平 1，2，马潇 1，2，王晓琳 3，4，李冬华 1，2，宋平顺 1，2

1.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省中藏药检验检测工程技术实验室，甘肃 兰州 730070；

3.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；4.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050

摘要：目的 建立测定当归中按不同比例掺入独活的 HPLC 分析方法及特征指纹图谱，为 HPLC 特征指纹图谱法甄别当归药材掺伪样品提供依据。方法 采用 Agilent TC-C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以

乙腈（A）-0.05%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～20 min，95%～75%B；20～60 min，75%～65%B；60～

80 min，65%～5%B），流速 1 mL/min，检测波长 254 nm，柱温 30 ℃。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价

系统》对当归、独活及掺伪样品的HPLC图谱进行比较分析。结果 当归和独活色谱图中各色谱峰分离良好， HPLC指纹图谱中有11个峰可作为区别点，其中7号峰为阿魏酸，32号峰为蛇床子素，34号峰为二氢欧芹醇当归酸酯。结论 本方法快速、简单易行，能够全面反映当归药材品质，可以明确判断当归中是否混入独活。关键词：当归；独活；高效液相色谱法；指纹图谱；掺伪DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.018中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)11-0083-04

Study on HPLC Fingerprint of Different Proportions of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix

ZHANG Ping1,2, MA Xiao1,2, WANG Xiao-lin3,4, LI Dong-hua1,2, SONG Ping-shun1,2

1. Gansu Institute for Drug Control, Lanzhou 730070, China; 2. Gansu Tibetan Medicine Examination Engineering Laboratory, Lanzhou 730070, China; 3. Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou

730050, China; 4. Gansu Institute of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China

Abstract: Objective To establish HPLC analysis methods and fingerprint of different proportions of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix; To use HPLC fingerprint method to identify the adulteration of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix. Methods Agilent TC-C18 column (5 μm, 4.6 mm × 250 mm) was adopted. Acetonitrile (A) - 0.05% phosphoric acid (B) was the mobile phase, and the gradient elution (0–20 min, 95%–75%B; 20–60 min, 75%–65%B; 60–80 min, 65%–5%B) was used; The flowrate was 1 mL/min; Detection wavelength was 254 nm; Column temperature was 30 ℃. The HPLC spectra of Angelicae Sinensis Radix, Angelicae Pubescentis Radix and adulterated samples were compared and analyzed by using TCM chromatogram fingerprint similarity evaluation system. Results Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Pubescentis Radix showed good chromatographic peaks in chromatogram separation. 11 peaks in HPLC fingerprint could be used as the mark, including 7th peak for ferulic acid, 32th peak for osthole, and 34th peak for columbianadin. Conclusion This method is rapid, simple and feasible, can fully reflect the quality of Angelicae Sinensis Radix and clearly identify whether Angelicae Pubescentis Radix is adulterated in Angelicae Sinensis Radix.

Keywords: Angelicae Sinensis Radix; Angelicae Pubescentis Radix; HPLC; fingerprint; adulteration

独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.F.biserrata Shan et Yuan 的干燥根，具有祛风除

基金项目：甘肃省食品药品科研项目（ 2017GSFDA012、

2017GSFDA017、2018GSFDA008 ）；甘肃省科技重大专项

（17ZDZFA009）

通讯作者：马潇，E-mail：2484649834@qq.com

湿、通痹止痛功效[1]。当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便功效[1]。独活主要含有蛇床子素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇、欧前胡素、异欧前胡素等成分，当归主要含挥发油（藁本内酯）、有机酸

（阿魏酸、亚油酸、硬脂酸）、多糖和黄酮等[2-5]。

当归和独活药材来源相近、外观性状差异不大[6]，

药材商品流通和临床用药时极易混淆。甄别药材市场上掺伪现象，传统的性状鉴别存在很大困难，中药指纹图谱技术则以其特征性和完整性而具有明显优

势[7]，因此，建立当归和独活药材指纹图谱对甄别药材真伪具有重要意义[8-10]。本研究通过 HPLC-DAD 建立当归、独活及当归中按不同比例掺入独活的指纹图谱，从而对当归与独活进行鉴别，在药品检验及临床应用中对掺假样品进行甄别，保证用药安全。1 仪器与试药Waters e2998 高效液相色谱仪（2998 DAD 检测器，Empower3 工作站），美国 Waters 公司；ME-204型分析天平，梅特勒公司；XMTD-4000恒温水浴锅，北京永光明仪器有限公司。

蛇床子素对照品（批号 110822-201308）、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号 111583-200402）、阿魏酸对照品（批号 110773-201313）、欧前胡素对照品（批

号 110826-201616），中国食品药品检定研究院；当归、

独活样品各5批，均由本课题组在甘肃、四川、湖北等地采集或购买，经甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师鉴定，分别为伞形科植物当归 Angelica sinensis

（ Oliv. ） Diels 的干燥根、伞形科植物重齿毛当归

Angelica pubesce Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根。乙腈为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果

2.1 掺伪样品的制备取当归、独活样品，粉碎，置自封袋中备用。取当归样品粉末10 g，共 5份，分别置烧杯中，放入分析天平称量，分别精密加入 0.5、1、2、3、4 g 独活样品粉末，混匀，制成分别含 5%、10%、20%、30%、

40%独活的掺伪当归样品，备用。2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

精密称取样品 1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL甲醇，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液精密称取蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯 80 μg的混合溶液，即得。

2.3 色谱条件

采用 Agilent TC-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，

5 μm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B） [4-5，11-12] ，

梯度洗脱（见表 2），流速 1 mL/min，检测波长 254 nm，

柱温 30 ℃，进样量20 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性及专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，结果表明各色谱峰分离度较好，峰形对称，专属性强。

2.4.2 精密度试验精密吸取当归供试品溶液，连续进样5 次，以 7号峰阿魏酸为内参比峰，测得各共有峰的相对保留时间 RSD 为 0.1%～0.5%，相对峰面积 RSD 为 1.5%～ 3.0%。精密吸取独活供试品溶液，连续进样5次，以32号峰蛇床子素为内参比峰，测得各共有峰的相对保留时间 RSD 为 0.3%～1.0%，相对峰面积 RSD 为2.0%～3.5%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定要求。2.4.3 稳定性试验取当归供试品溶液，于制备后 0、4、8、16、24 h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间 RSD 为0.2%～1.5%，相对峰面积 RSD 为 1.1%～2.8%。取独活供试品溶液，于制备后0、4、8、16、24 h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间 RSD 为 0.5%～

2.0%，相对峰面积 RSD 为 1.6%～3.2%。表明供试液在 24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验精密称取当归样品5 份，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样并记录。测得各共有峰的相对保留时间RSD 为 0.1%～0.4%，相对峰面积的

RSD 为 0.7%～2.8%。符合指纹图谱要求。

2.5 指纹图谱分析2.5.1 指纹图谱的建立与主要色谱峰的确认

按“2.3”项下色谱条件分别对当归及独活供试品溶液进行测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价

系统（2012 版）》软件，分别对当归和独活进行色谱峰匹配，生成指纹图谱（见图1、图2），并计算各批次样品指纹图谱与各自生成的对照图谱的相似度，结果当归和独活的指纹图谱相似度均在0.9 以上。