基于网络药理学的补肾益心片治疗高血压分子机制研究

刘云娣1，高佳珠2，杨智华2，麦喆钘2，孙治中2，李俊哲2，温俊茂 2

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学，广东 广州 510405摘要：目的 采用网络药理学方法分析补肾益心片治疗高血压的作用机制，为其临床与应用提供参考。方法 检索中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）获取补肾益心片活性成分，运用 DRAR-CPI 服务器、GeneCards 和 OMIM等数据库筛选活性成分治疗高血压的作用靶点。采用 Cytoscape3.6.0 软件构建补肾益心片活性成分-高血压靶点网络。结合 String 数据库和 Cytoscape 的 NetworkAnalyzer 分析蛋白相互作用关系。采用Systems Dock Web Site进行活性成分与靶点分子对接。并进行GO 分析、KEGG通路富集分析。结果 筛选出补肾益心片活性成分 30 个，作用于 62 个靶点，主要通过调节肾素-血管紧张素系统、Toll 样受体信号通路、

PI3K-AKT 信号通路和 Jak-STAT 信号通路等发挥治疗高血压的作用。结论 本研究初步揭示了补肾益心片治疗高血压的多成分、多靶点作用机制，可为后续研究提供参考。关键词：补肾益心片；高血压；网络药理学；靶点；通路

中图分类号：R2-05；R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)08-0104-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

高血压主要发生于中老年人群，但有逐渐呈年轻化趋势。目前主要采用改善患者生活方式并配合药物治疗的方式，以达到将血压降至正常血压值的治疗目标。但高血压常伴多种并发症，难以根治。

补肾益心片是广州中医药大学第一附属医院多年来治疗各种高血压的常用中药复方制剂。临床观察显示补肾益心片可明显改善患者生活质量、生理症基金项目：国家自然科学基金（81403225）状、性功能、工作状态、生气和活力、睡眠等方面的问题[1]。补肾益心片主要组成药物为淫羊藿和车前

子[2]。研究表明，补肾益心片可调节血压，促一氧化氮合成、抗血小板聚集、利尿，对心、脑、肾等靶器官具有保护作用，还可使血浆过氧化脂质下降，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶回升，调节睾酮和

雌二醇水平[2-3]。同时，补肾益心片对高血压患者肾

素-血管紧张素-醛固酮系统具有调节作用[4]。但目前研究大多关注药物对个体和个别分子的影响，补肾益

心片治疗高血压的有效活性成分及作用机制尚不明确。其药理学研究仍处于单基因-单靶点研究阶段，系统性研究鲜见报道。本研究采用网络药理学方法，分析补肾益心片的化学成分、作用靶点、信号通路，并进行GO分类富集分析及KEGG通路富集分析，分析“药物-基因-靶点-疾病”间的关系，并进行可视化展示，为其临床与应用提供参考。1 资料与方法1.1 药物化学成分和活性成分的获取登录中药系统药理学数据库和分析平台（http://lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP），分别以补肾益心片组成药物“淫羊藿”“车前子”为关键词检索，获得2种药物的化学成分信息，包括成分编号（Mol ID）、分子量（MW）、脂水分配系数（AlogP）、氢键供体（Hdon）、氢键受体（Hacc）、口服生物利用度（OB）、

Caco-2 渗透率、血脑屏障（BBB）、类药性（DL）、负分数可表达面积（FASA-）。考虑到中药成分纷繁复杂，必非所有成分均能进入体内发挥作用，选取同时满足 OB＞30%、DL＞0.18 的化学成分，作为其活性成分。

1.2 活性成分作用靶点获取

利用 Discovery Studio 4.0对成分进行预处理，选择 Minimize ligands 模块，在 CHARMm 力场下采用共轭梯度法与最陡下降法相结合的能量优化算法，进行成分的能量最小化分析。然后采用BEST 模式对分子进行多构象的生成。通过 Chembiodraw Ultra 12.0软件绘制出淫羊藿-车前子的活性成分3D结构图，以

mol2 格式保存。

将活性分子的3D结构上传到 DRAR-CPI 服务器（http://cpi.bio-x.cn/drar/），基于反向分子对接方法，对活性成分和蛋白相互作用的亲和性进行打分。按照服务器推荐，选定 Z-score＜-0.5 的蛋白作为淫羊藿车前子活性分子的预测靶点。通过 UniProtKB 数据库（https://www.uniprot.org/）检索淫羊藿-车前子活性分子预测靶点的PDB ID，检索字段为“All Fields”，限定物种为“human（人）”，以获取预测靶点相应基因。

1.3 高血压相关靶点基因获取

分别在 GeneCards 数据库（https://www.genecards. org/）和 OMIM 数据库（https://www.omim.org/）以“hypertension”或“HTN”为关键词检索与高血压病相关的靶点基因。将相关的靶点基因和淫羊藿-车前子活性分子的预测靶点基因录入 Excel 表格，进行两者的对比，筛选出共同部分，作为淫羊藿-车前子活性成分抗高血压的潜在作用靶点。

1.4活性成分-作用靶点网络构建将补肾益心片活性成分与抗高血压作用靶点导入 Cytoscape3.6.0软件，构建活性成分-作用靶点网络。

1.5 核心靶点相互作用网络构建与分析

以 String 数据库（https://string-db.org/）为背景网络数据库，将补肾益心片活性分子抗高血压的潜在靶点导入 String 数据库，限定物种为“homo sapiens”，检索获得蛋白相互作用关系，以TSV格式保存结果。再将其导入 Cytoscape3.6.0 软件绘制蛋白相互作用关系网络，并用 Cytoscape 的 NetworkAnalyzer 工具进行网络分析，根据 degree 值（连接度）调节节点的大小、颜色，以获取最终的蛋白相互作用网络。

1.6 分子对接

通过 System Dock Web Site 进行分子对接得出的Docking 评分，可评估配体-受体的结合潜力[5]。因此，基于上述的蛋白相互作用网络，筛选出degree 值最高的 5 个靶点，并导入 System Dock Web Site 服务器（http://systemsdock. unit.oist.jp/iddp/home/index），按照服务器原始参数设定，与淫羊藿-车前子活性分子进行对接。通过对结果的 Docking 评分进行分析，评估活性分子与核心靶点之间的结合潜力。

1.7 生物学过程与信号通路分析

DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）为大量基因或蛋白提供系统全面的生物功能注释信息，并能

找出最显著富集的生物学注释[6]。将补肾益心片活性分子作用靶点导入DAVID数据库，Select Identifier 设为“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 设为“Gene List”，限定物种为“human”，进行 GO分析和 KEGG信号通路富集分析，得到并保存结果。选取满足 P＜0.001 的通路和生物过程，并根据富集基因数的大小，选取排名前 20 位的信号通路，使用OmicShare 网站（http://www.omicshare. com/）绘图。

1.8 成分-靶点-通路网络构建通过分析富集基因数排名前20 位的 KEGG 信号通路，结合相关文献检索，筛选出可能与抗高血压相关的信号通路，找出富集在这些通路上淫羊藿-车前子抗高血压的靶点，并与相应药物的活性分子相配对，构建成分-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 补肾益心片活性成分

TCMSP 收集到淫羊藿化学成分 130 个，车前子化学成分 55个。经筛选，得到活性成分30 个，其中淫羊藿活性成分23个、车前子活性成分9个，如木犀草素（luteolin）、槲皮苷（quercetin）、谷甾醇（sitosterol）、

山柰酚（kaempferol）和高车前苷元（Dinatin）等，见表1。

2.2靶点预测

30 个活性成分在 DRAR-CPI 服务器中得到

Z-score＜-0.5 的靶点有 62 个，在 UniProtKB 数据库中输入这些蛋白靶点的PDB ID，获得62个基因靶点。再与OMIM与GeneCards数据库的高血压相关靶点基因进行比对，筛选出与高血压相关的作用靶点62 个，见表2。

2.3活性成分-靶点网络

在 Cytoscape3.6.0 软件中导入活性成分与作用靶点的信息及对应关系，构建活性成分-靶点网络，见图1。此网络包括 92 个节点、487条边。节点代表活性成分与作用靶点，而边则代表成分与靶点之间存在相关关系。不同的靶点可对应同一个的活性成分，单个靶点也可与不同的活性成分相对应，由此可见淫羊藿-车前子治疗高血压具有多成分、多靶点的特点。

2.4 核心靶点相互作用网络

将 62 个潜在靶点导入 String 数据库中，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，使用 Cytoscape3.6.0软件绘制相互作用网络，见图 2。此网络共包括 62

个节点、352 条边。图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联。degree值越大则节点越大、颜色越深，结果提示 degree 值最高的5个潜在靶点分别是 IL-6、

VEGFA、TNF、EDN1、TGFB1。

2.5分子对接结果degree值高意味着该蛋白在补肾益心片活性分子治疗高血压中具有重要作用。在 Systems Dock Web Site 服务器中输入关键靶点 TNF、IL-6、VEGFA、

EDN1、TGFB1 的 PDB ID，并与 30个活性成分进行对接（见图3）。结果显示有 18 个的 Docking 评分＞

7.0，有 79 个在 7.0～5.0 之间，有 45 个在 5.0～4.25

之间，＜4.25 的 18 个。当 Docking 评分＞4.25 时表

示分子和靶点具有一定结合能力，＞5.0 时表示结合

能力较高，＞7.0 时表示结合能力高。由此可见，补肾益心片的活性成分和关键靶点的结合能力良好。

2.6 GO分析和 KEGG通路富集分析结果对潜在靶点进行GO分析和 KEGG 分析，以P＜

0.01为阈值筛选富集数量较多的通路与生物过程，其中富集占相应通路比例越大、P值越小的通路，与补肾益心片活性分子治疗高血压的关系更密切。GO 分析和 KEGG通路富集分析结果见图4～图7。风险系数为富集在该通路的靶点与通路靶点总数的比值。

2.7 活性成分-靶点-信号通路网络

从 KEGG结果排名前20位的信号通路中筛选出可能与高血压相关的5条，并将其与补肾益心片的活性成分、作用靶点一一对应，构建成分-靶点-通路多维网络，见图 8。由图分析可得，补肾益心片治疗高血压涉及的活性成分共 10 个，包括木犀草素、槲皮苷、谷甾醇等，靶点有 TNF、IL-6、VEGFA 等，主要涉及肾素-血管紧张素系统、Toll样受体信号通路、

PI3K-AKT 信号通路和 Jak-STAT 信号通路。

讨论补肾益心片中淫羊藿性温，具有补肾壮阳之功；车前子性寒，具有清肝利水等作用。二药合用，一温一寒，一补一清，具有补肾清肝的功效。

本研究收集到补肾益心片组成中具有治疗高血压作用的活性成分共 30 个，如木犀草素、槲皮苷、谷甾醇、山柰酚和高车前苷元等。通过 30 个活性成分收集到可能与高血压相关的作用靶点 62 个。表明补肾益心片治疗高血压具有多成分、多靶点特点。成分-靶点网络也体现了该特点。此外，靶点相互作用网络呈现出补肾益心片活性分子治疗高血压的各蛋白靶点之间关系密切，提示其作用机制复杂多样，非单一蛋白靶点作用而成。分子对接试验显示，补肾益心片活性成分和关键靶点之间结合能力良好，说明本研究数据及结果准确度较高，在此基础上进行网络分析结果具一定参考价值。

GO 和 KEGG 通路富集分析与成分-靶点-通路网络结果显示，补肾益心片治疗高血压涉及肾素-血管紧张素系统、Toll 样受体信号通路、PI3K-AKT 信号通路和 Jak-STAT 信号通路等。

肾素-血管紧张素系统人体重要的体液调节系统，调节血压和水-电解质平衡。机体可合成血管紧张素Ⅰ，进而合成血管紧张素Ⅱ，然后激活其 AT1受体，发挥收缩血管、再吸收肾钠离子、分泌醛固酮、增加血压和促进高血压发生的作用。因此抑制肾素血管紧张素系统可有效治疗高血压，补肾益心片可能通过影响机体肾素-血管紧张素系统改善高血压的病理状态。

Toll 样受体信号通路中 TLR4 介导的先天及适应性免疫反应参与高血压慢性血管炎性反应，其对血压调控的机制主要与TLR4介导内皮细胞炎性损伤及血

管反应性增强有关[7]。TLR4的表达增强可升高血压，而抑制 TLR4可降低血压。通路分析结果显示，补肾益心片可能通过影响TLR4的表达起到治疗高血压的作用。

延髓头端腹外侧区（RVLM）是交感神经调控的关键中枢，在维持基础血压和保持交感神经紧张中具有重要作用。此中枢内 PI3K-AKT 信号通路参与了血压的调节。在高血压大鼠RVLM 中 PI3K 通路明显上调，其失活导致RVLM内活性氧簇产生减少，改善高

血压心血管功能[8]。本研究结果提示，淫羊藿-车前子可能通过影响 PI3K-AKT 信号通路而治疗高血压。

Jak-STAT 信号通路是大多数细胞因子及活性物

质发挥生物作用的共同通路。血管紧张素Ⅱ1 型受体

（AT1）自身抗体 AT1-AAs 有促细胞增殖的作用，而Jak-STAT 信号通路的激活参与了 AT1-AAs 所致的血管平滑肌细胞增殖效应，从而参与了高血压病的发生

发展[9]。补肾益心片可能影响 Jak-STAT 信号通路的激活，起到治疗高血压的作用。

综上，补肾益心片治疗高血压涉及多种活性成分、作用靶点及信号通路。本研究通过分子对接验证了检索数据，所得结果与现有文献报道符合，但该研究结果还需进一步实验验证。

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（收稿日期：2019-01-13）

（修回日期：2019-02-28；编辑：向宇雁）