CJI (Traditional Chinese Medicine)
斑蝥素半乳糖化脂质体冷冻干燥工艺及性质研究 ································· 乔勇，唐颖楠，周莉莉，邹蔓姝，夏新华
乔勇，唐颖楠，周莉莉，邹蔓姝，夏新华湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208
摘要：目的 制备斑蝥素半乳糖化脂质体（Lac-CTD-Lips）冻干粉，并对其理化性质进行考察。方法 利用冷冻干燥法制备 Lac-CTD-Lips 冻干粉，以粒径、外观、复溶时间及复溶后外观为指标，采用单因素试验筛选冻干处方最佳工艺，考察冻干前后脂质体的形态学变化、粒径、pH值及包封率。结果 采用内外加法，冻干保护剂的质量浓度为20%，甘露醇-海藻糖比为3∶2，以速冻的方式，于-50 ℃冻干机冷阱预冻，冷冻干燥
24 h，可获得较满意的冻干粉。与冻干前比较，冻干后脂质体形态未发生明显变化；冻干前后脂质体的粒径分
别为（211.6±0.05）nm、（233.2±0.12）nm，Zeta 电位分别为（0.08±0.01）mV、（-3.30±0.21）mV，包封率
分别为（86.11±0.64）%、（84.20±0.15）%。结论 Lac-CTD-Lips 冻干工艺稳定、可行，可为其进一步研究奠定基础。
关键词：斑蝥素；半乳糖化脂质体；冻干粉；粒径
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)10-0070-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
目前肝癌主要采用手术和药物治疗，其中手术治疗占主要地位，而现有的抗癌药物生物利用率低，毒副作用大，且易产生耐药性，对肿瘤组织特异性差，
常引起多重不良反应[1]。因此，开发高效低毒且具有
靶向性的抗肝癌制剂势在必行[2-4]。斑蝥素（cantharidin，CTD）是斑蝥体内提取的
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81573621）
通讯作者：夏新华，E-mail：xhxia001@sina.com倍半萜类衍生物。研究表明，斑蝥素具有增强机体免疫功能、改变多种蛋白表达、抑制肿瘤细胞增殖等药
理作用[5-6]。但斑蝥素水溶性差、口服生物利用度低、
毒性大，限制了其在临床肿瘤治疗方面的应用[7-10]。脂质体是由脂质双分子层所形成的一种超微球形载体制剂，是纳米载药系统的典型代表。目前，以新型脂质体为载体的多种药物递送系统在介导基因治疗、
靶向给药、抗肿瘤等方面显示出独特的优势[11]。普通斑蝥素脂质体（CTD-Lips）易被机体免疫识
别吞噬。肝实质细胞内存在去唾液酸糖蛋白受体（asialogly-coprotein receptor，ASGPR），亦称半乳糖受体，可高效识别半乳糖残基，本课题组前期合成了肝靶向分子硬质醇乙酰化半乳糖苷，并对斑蝥素半乳糖化脂质体（Lac-CTD-Lips）的处方配比和制备工艺
进行了优选[12]，制备出的 Lac-CTD-Lips 可靶向于肝脏，既提高药物在病灶的局部浓度，又减少药物对其他非靶向组织的毒副作用。然而，液态 Lac-CTD-Lips在贮存期间易发生聚集、融合及药物渗漏；同时，天然磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要
求[13]。真空冷冻干燥技术制备冻干脂质体是目前提高脂质体稳定性以解决液态脂质体无法长期贮存问题的最佳方法。冻干制剂特有的疏松多孔结构，可使药物易于重新复溶而恢复活性；而且冻干制剂含水量低，易于长期稳定保存，可有效避免脂质体以水溶液
方式贮存而导致的一系列问题[14-16]。本研究制备Lac-CTD-Lips 冻干粉，优化冻干处方工艺，并考察冻干制剂的理化性质，为探索解决脂质体类制剂的贮存稳定性问题提供依据。
1 仪器与试药
SCIENTZ-10Z 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技有限公司；Zetasizer Nano ZS纳米粒度及 Zeta 电位仪，
英国马尔文仪器有限公司；YP1002 分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；Tecnai G2 Spiri 透射电子显
微镜，美国赛默飞公司；FE20型 pH计，梅特勒托利多公司；
斑蝥素原料药，西安通泽生物科技有限公司，含量99.4%；斑蝥素，中国食品药品检定研究院，批号
110783-2011105，含量 98.6%；氢化大豆磷脂、蛋黄磷脂、合成磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱、大豆磷脂，德国 Lipoid公司；胆固醇、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、甘氨酸，国药集团化学试剂有限公司；十八醇半乳糖苷，本实验室合成；葡聚糖凝胶G-50，通用电气医疗公司；蔗糖，广东光华科技有限公司；乳糖，天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠，湖南汇虹试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 冻干脂质体制备采用乙醇注入法制备 Lac-CTD-Lips。精密称取斑蝥素、磷脂、胆固醇、十八醇半乳糖苷适量，溶于一定量无水乙醇中，超声溶解后，将其缓慢滴入预热的pH 6.4磷酸盐缓冲液中，并置于55 ℃水浴中磁力搅拌（转速 200 r/min）。减压蒸馏除去无水乙醇，用磷
酸盐缓冲液定容，探头超声（冰浴）20 min，分别用
0.45 μm 和 0.22 μm 微孔滤膜过滤进行整粒，即得Lac-CTD-Lips（该处方为本实验室优化的最佳处方）。移取 2 mL脂质体溶液至有冻干保护剂的称量瓶中，摇匀，将样品进行预冻。预冻后开启真空泵，减压至
1 Pa，进行真空干燥，即得 Lac-CTD-Lips 冻干粉。将冻干脂质体粉末加入纯净水至冻干前的体积，摇匀，溶解，即得重建脂质体。
2.2 冻干脂质体评价指标
2.2.1 冻干后外观以保持原体积、饱满、无萎缩、不坍塌、可整块
脱落但不破碎为佳。+++：松散、光滑、平整饱满；
++：轻度皱缩、坍塌；+：严重皱缩、塌陷；-：不能成型。
2.2.2 复溶后粒径测定复溶后的脂质体粒径，较冻干前脂质体粒径（平均粒径为 200 nm）变化较小者为佳。
2.2.3 复溶时间按冻干前体积加入纯化水于冻干脂质体中，振摇
即可全部迅速溶解为佳。+++：振摇1 min 内能复溶成
均匀混悬液，无不溶颗粒或团块；++：振摇1～3 min
能复溶成较均匀混悬液，无不溶颗粒或团块；+：振摇 5 min内能复溶成较均匀混悬液，肉眼可见少量不溶颗粒；-：振摇 5 min后仍不能复溶成较均匀混悬液，黏壁，肉眼可见部分不溶颗粒或团块。
2.2.4 复溶后外观按冻干前体积加入纯化水于冻干脂质体中，振摇
溶解后脂质体仍呈淡蓝色乳光为佳。+++：淡蓝色乳
光，浊度较低；++：淡蓝色乳光，浊度较高；+：白色乳光，浊度较高；-：外观浑浊。
2.3 冷冻干燥工艺单因素考察
2.3.1 预冻方式考察预冻方式分为慢冻和速冻2种。本试验分别考察
了冰箱-20 ℃慢冻、速冻及冻干机冷阱-50 ℃慢冻、速冻 4 种方式，发现冰箱-20 ℃慢冻（5 ℃放置1 h，
-6 ℃放置8 h，-20 ℃放置3 h）、速冻（直接于-20 ℃放置 12 h）与冻干机冷阱-50 ℃慢冻（-6 ℃放置1 h，
-20 ℃放置 8h，-50 ℃放置3 h）的冻干样品表面不
平整，复溶后粒径也略有增加。而冻干机冷阱-50 ℃
速冻（直接于-50 ℃放置 12 h）的样品外观完好，复溶后粒径变化不明显，因此选择预冻方式为冻干机冷
阱-50 ℃速冻。
2.3.2 干燥时间考察
干燥一般分为2个阶段，即升华干燥和解析干燥。升华干燥阶段可除去样品中大部分自由水，解析干燥
阶段是除去样品中剩余的少量自由水及结合水，但在
实际干燥过程中，2 个干燥阶段很难区分。因此，本试验考察总干燥时间为 12、18、24、32 h对冻干产品的影响，结果干燥12、18 h的脂质体没有彻底冻干，干燥 24、32 h的脂质体外观完好，且复溶后粒径变化不明显，因此确定干燥时间为24 h。
2.4 冻干保护剂及其加入方式筛选
2.4.1 单一冻干保护剂考察选用甘露醇、海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘氨酸和氯化钠为保护剂，固定保护剂质量浓度为
20%，冻干保护剂的添加方式为外加，以冻干样品外观和粒径为主要评价指标，以复溶时间和复溶后外观为辅助参考指标，对冻干保护剂进行筛选。结果表明，使用单一保护剂冻干效果不理想。见表1。
2.4.2 2种冻干保护剂联用配比考察基于上述单一冻干保护剂的考察及预试验，考虑以甘露醇、海藻糖两者联用作为冻干保护剂。固定保护剂质量浓度为20%，甘露醇与海藻糖的配比分别为
1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1。冻干保护剂的添加方式为外加，对2种保护剂的配比进行筛选，结果表明，甘露醇与海藻糖的配比以3∶2为佳，见表2。
2.4.3 冻干保护剂加入方式考察冻干保护剂的加入方式一般分为内加法、外加法及内外加法。本试验固定冻干保护剂的质量浓度为
20%，甘露醇与海藻糖的配比为3∶2，内外加法为先内加少量海藻糖后外加甘露醇与海藻糖。结果表明，保护剂的加入方式对冻干后外观、粒径、复溶时间、复溶后外观均无明显影响，但对粒径分布具有一定影响。内外加法制得的冻干脂质体粒径分布图为一单峰，而单纯的内加法、外加法制得的冻干脂质体粒径
分布图出现双峰（粒径＞1000 nm脂质体占比分别为
3.9%、27.4%），因此，冻干保护剂的加入方式以内外加法为佳。见表3、图 1。
2.4.4冻干保护剂内加海藻糖量考察本试验固定冻干保护剂的质量浓度为20%，甘露醇与海藻糖的配比为3∶2，设计内加海藻糖量分别为海藻糖总量的 0%、12.5%、25.0%、37.5%（即外加甘露醇与海藻糖的配比分别为 3∶2、3∶1.75、3∶1.5、
3∶1.25）。结果表明，脂质体进行冷冻干燥时，内加海藻糖量为海藻糖总量的37.5%为佳。见表 4。
2.5斑蝥素冻干脂质体最佳制备方法验证采用乙醇注入法制备 Lac-CTD-Lips，即精密称取斑蝥素、磷脂、胆固醇、十八醇半乳糖苷适量，溶于一定量的无水乙醇，超声溶解后，将其缓慢滴入预热的 pH 6.4磷酸盐缓冲液中，并置于55 ℃水浴中搅拌（转速 200 r/min）。减压蒸馏除去无水乙醇，用磷酸
盐缓冲液定容，探头超声（冰浴）20 min，分别采用
0.45 μm 和 0.22 μm 微孔滤膜过滤进行整粒，即得Lac-CTD-Lips。移取 2 mL脂质体溶液至含 0.75 海藻糖的称量瓶中，外加 3∶1.25 甘露醇-海藻糖（冻干保护剂的质量浓度为 20%，甘露醇∶海藻糖＝3∶2），
摇匀，将样品以速冻方式（-50 ℃）进行预冻。预冻
12 h后开启真空泵，减压至1 Pa，真空干燥 24 h，即得 Lac-CTD-Lips 冻干品。
2.6 冻干前后理化性质考察
2.6.1 外观形态
乙醇注入法制备的 Lac-CTD-Lips 外观为半透明胶体溶液，有淡蓝色乳光；冻干品外观饱满，可见明显的疏松结构，呈白色；复溶后脂质体为乳白色半透明胶体溶液。
2.6.2 透射电镜观察取适量冻干前和冻干后复溶的 Lac-CTD-Lips 混悬液样品，用 2%磷钨酸负染法制样，干燥后置于透射电镜下观察脂质体形态，结果见图2、图3。在透射电镜下，Lac-CTD-Lips 外观圆整、大小均一，冻干后复溶的 Lac-CTD-Lips 为不规则圆形球粒，分散均匀。
2.6.3粒径取适量冻干前及冻干后复溶的脂质体混悬液样品，于 Nano ZS 纳米粒度及 Zeta 电位仪测定其平均粒径及分布。结果表明，相对于冻干前，冻干后脂质体粒径稍有增大，冻干前 Lac-CTD-Lips 的平均粒径
为（211.6±0.05）nm，复溶后平均粒径为（233.2±
0.12）nm，二者粒径分布图均呈现一个单峰，见图4。
2.6.4 Zeta 电位取少量冻干前与冻干后复溶的脂质体混悬液，稀释相同倍数，用 Nano ZS 纳米粒度及 Zeta 电位仪测定其 Zeta 电位。结果显示，Lac-CTD-Lips 冻干前的Zeta 电位为（0.08±0.01）mV，复溶后 Zeta 电位为
（-3.30±0.21）mV，表明冻干前后电位无明显变化，见图5。
2.6.5 pH 值
取冻干前与冻干后复溶的脂质体混悬液适量，用pH 计测定 Lac-CTD-Lips 冻干前后样品 pH 值，结果见表5。
2.6.6包封率精密量取冻干前与冻干后复溶的 Lac-CTD-Lips混悬液各1 mL，加入 9 mL甲醇-乙腈混合溶液，超声使其澄清，微孔滤膜过滤后HPLC进样分析，计算总药量。另精密量取冻干前与冻干后复溶的脂质体溶液各 0.5 mL，加于 Sephadex G-50凝胶柱顶部（直径
1.5 cm，柱床高 20 cm），以蒸馏水洗脱，洗脱流速为
2 mL/min。收集 22～46 mL脂质体部分，减压蒸至
1 mL，用甲醇-乙腈混合溶液定容至10 mL，超声使其澄清，过 0.22 μm微孔滤膜，HPLC进样分析，计算包封的药物含量，计算其包封率。包封率（%）＝
系统中包封的药量÷系统中总药量×100%。结果表明，冻干前后脂质体的包封率变化不大，见表6。3 讨论本试验对乙醇注入法制得的 Lac-CTD-Lips 进行冷冻干燥研究，以冻干样品外观、粒径、复溶时间及复溶后外观为评定指标，考察预冻方式、干燥时间、冻干保护剂种类、加入方式及用量对冻干前后脂质体的影响，最终确立 Lac-CTD-Lips 的最优冻干工艺条件为：加入质量浓度为20%的甘露醇-海藻糖（3∶2）
作为冻干保护剂，速冻温度为-50 ℃，预冻时间为
12 h，干燥时间为 24 h。筛选冻干保护剂发现，单一冻干保护剂难以满足脂质体系统的需要，故考虑将2种冻干保护剂联用。试验结果表明，对于 Lac-CTD-Lips，将甘露醇和海藻糖联用，并采用内外加法（先内加适量海藻糖再外加联用冻干保护剂）可获得较好的冻干效果。
对 Lac-CTD-Lips 冻干制剂进行了制剂学评价，考察了脂质体冻干前后形态学变化，结果表明，冻干脂质体可见明显的疏松结构，外形饱满，色泽均匀；
冻干品再分散性良好，复溶性较好，60 s内即可溶解完全；脂质体冻干后粒径略有增大，Zeta电位无明显
变化，体系稳定性没有降低；包封率＞80%。冷冻干燥过程对脂质体磷脂双分子层有一定破坏作用，易造成脂质体融合和药物泄漏。一方面，由于冷冻时外水相先形成冰晶，导致外水相盐浓度增大，脂质体膜内外渗透压增大，药物容易泄漏；另一方面，干燥时，脱水作用破坏磷脂与水分子之间的氢
键，促使脂质体膜发生融合[17]。糖类作为冻干保护剂，可有效防止以上现象发生，其机制主要为水置换假
说[18]。由于糖类自身带有多羟基结构，在冷冻干燥过程中，可代替失去的水分子，与磷脂极性基团相结合形成氢键，对脂质体进行保护，维持脂质体结构的完
整性[19]。本试验利用磷脂对脂溶性药物斑蝥素的包覆，促进药物在水性介质中的分散，针对性地解决了斑蝥素用于临床的一些缺点，并为其他脂溶性药物开发提供了新的研究途径。利用冷冻干燥技术将 Lac-CTD-Lips制成冻干制剂，有助于提高其贮存的稳定性，并可为进一步开展 Lac-CTD-Lips 肝靶向性与抗肝肿瘤作用研究奠定基础。
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（收稿日期：2018-09-30）
（修回日期：2018-10-22；编辑：陈静）