香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织PI3K信号通路相关因子表达的影响

段永强 1，2，3，4，巩子汉 1，3，王丽园 1，5，成映霞 1，王强1，杨晓轶1，李兰珍1，段云燕 1

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000；

3.甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃 兰州 730000；

4.敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；5.苍溪县中医医院，四川 苍溪 628400摘要：目的 观察香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎（CAG）大鼠胃组织血管内皮生长因子（VEGF）、磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）的影响，探讨该复方防治 CAG的作用机制。方法 将 120 只 Wistar 大鼠分为空白组和模型组，采用综合法制作CAG 动物模型，将成模大鼠分为模型组、维酶素组和香砂六君子汤高、中、低剂量组，空白组和模型组大鼠给予10 mL/（kg•d）蒸馏水灌胃，香砂六君子汤高、中、低剂量组分别给予24、12、6 g/（kg•d）香砂六君子汤灌胃，维酶素组给予 0.30 g/（kg•d）维酶素灌胃，连续 120 d。ELISA 检测大鼠胃组织VEGF 含量，RT-PCR 和 Western blot 分别检测大鼠胃组织 PTEN、PI3K、AKT 基因和蛋白的表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠一般状况较差，胃黏膜变薄，上皮细胞及腺体排列紊乱、稀疏，腺体数目明显减少，黏膜肌层增厚向固有层延伸，可见大量炎性细胞浸润，胃组织 PTEN 基因及蛋白表达显著降低（P＜0.01），VEGF 含量和 AKT、PI3K 基因及蛋白表达

显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组大鼠胃组织PTEN 基因表达显著升高（P＜0.01）， VEGF 含量和 AKT、PI3K 基因及蛋白表达显著降低（P＜0.01）。结论 香砂六君子汤通过改善模型大鼠生存状况及胃黏膜病理状态，上调胃组织PTEN表达，下调 VEGF、AKT、PI3K 表达，发挥治疗CAG的作用。

关键词：慢性萎缩性胃炎；血管内皮生长因子；磷酸酶张力蛋白同源物基因；磷脂酰肌醇 3-激酶；蛋白激酶B；香砂六君子汤；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201907062

文章编号：1005-5304(2020)03-0033-06开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on PI3K Signaling Pathway Correlation Factor Expression in Gastric Tissue of Rats with Chronic Atrophic Gastritis

DUAN Yongqiang1,2,3,4, GONG Zihan1,3, WANG Liyuan1,5, CHENG Yingxia1,

WANG Qiang1, YANG Xiaoyi1, LI Lanzhen1, DUAN Yunyan1

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Gansu Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China;

4. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation of Ministry of Education, Lanzhou 730000, China;

5. Cangxi County Traditional Chinese Medicine Hospital, Cangxi 628400, China

Abstract: Objective To observe the effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on vascular endothelial growth factor (VEGF), phosphatase tensin protein homologue (PTEN), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and protein kinase B (AKT) in gastric tissue of rats with chronic atrophic gastritis (CAG); To discuss the mechanism of this

基金项目：国家自然科学基金（81260519、81760830）；甘肃省中医药管理局基金（GZK-2014-73）；甘肃省自然科学基金

（1610RJZA063）；甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室开放基金（ZYFYZH-KJ-2016-006）

通讯作者：王丽园，E-mail：179614017@qq.com

compound for prevention and treatment of CAG. Methods Totally 120 SPF Wistar rats were randomly divided into blank group and model group. CAG animal models were reproduced by comprehensive method. The model rats were randomly divided into model group, vitacoenzyme tablets group and Xiangsha Liujunzi Decoction high-, medium- and low-dosage groups. The blank group and model group were given 10 mL/(kg·d) distilled water for gavage, and Xiangsha Liujunzi Decoction high-, medium- and low-dosage groups were given 24 g/(kg d), 12 g/(kg d), and 6 g/(kg·d) Xiangsha Liujunzi Decoction, respectively, for gavage. Vitacoenzyme tablets group was given 0.30 g / (kg·d) vitacoenzyme tablets, for consecutive 120 d. The content of VEGF in gastric tissue was detected by ELISA, and the gene and protein expressions of PI3K, PTEN and AKT were detected by RT-PCR and Western blot, respectively. Results Compared with the blank group, the general survival condition of the model group was worse; the gastric mucosa of the model group was thinner, the arrangement of epithelial cells and glands was disordered and sparse, the number of glands was significantly reduced, the muscular layer of the mucosa was thicker and extended to the lamina propria, a large number of inflammatory infiltration could be seen, PTEN gene and protein expression in gastric tissue were significantly reduced (P<0.01), and the content of VEGF and the gene and protein expressions of AKT and PI3K in gastric tissues significantly increased (P<0.01). Compared with model group, the gene expression PTEN in gastric tissue of rats in Xiangsha Liujunzi Decoction high-dosage group was significantly higher (P<0.01), and the content of VEGF and gene and protein expressions of AKT and PI3K in gastric tissues significantly decreased (P<0.01). Conclusion Xiangsha Liujunzi Decoction can exert the therapeutic effect on CAG by improving the general survival of the model rats and the pathological state of gastric mucosa, up-regulating the expression of PTEN in gastric tissue, down-regulating the expression of VEGF, AKT and PI3K.

Keywords: chronic atrophic gastritis; vascular endothelial growth factor; PTEN; PI3K; AKT; Xiangsha Liujunzi Decoction; rats

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）多因素体脾胃虚弱、饮食不节、情志失调、感受外邪导致中焦气机不利、升降失司而引发，常表现出胃脘痞满、疼痛、纳呆、嗳气、大便不调、消瘦等症状。诸多医家经长期临床观察总结认为，CAG 病位在脾胃，其病机关键是脾胃虚弱。脾主升清，胃主通降，脾胃为一身气机升降之枢纽，若脾胃受损，脾失健运，胃失和降，则中焦气机紊乱，气血生化乏源，脏腑失

养而致胃痞[1-3]。正如《素问病机气宜保命集》所云： “脾不能行气于肺胃，结而不散则为痞。”临床应用香砂六君子汤治疗 CAG 疗效显著[4]，且本课题组前期研究表明，香砂六君子汤可调控 CAG 大鼠 NF-κB

通路进而抑制炎症因子白细胞介素（IL）-12、肿瘤坏

死因子-α、IL-1β 和 IL-8 的高表达，改善CAG大鼠胃排空功能、促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境缺氧诱

导因子（HIF）-1α 基因和蛋白表达，调控 IL-6、IL-10及热休克蛋白70基因及蛋白表达，对CAG大鼠胃窦

黏模具有保护作用[5-7]。有研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）参与肿瘤的进展、浸润和转移，其高

表达与肿瘤进展有关[8]。PI3K/AKT 信号通路是细胞内重要的信号转导通路，参与调节细胞的凋亡、增生、

迁移、分化和代谢[9]。PI3K/AKT 信号通路与胃上皮细胞的增殖和凋亡关系密切，胃上皮细胞增殖过度而

凋亡不足时，则可能导致胃癌的发生[10]。本研究旨在通过动物实验观察以健脾理气和胃法为指导的香砂六君子汤对 CAG 大鼠生存状况、胃组织 VEGF、磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）、磷脂酰肌醇 3

激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（AKT）表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。材料与方法

动物

SPF 级健康 Wistar 大鼠 120只，雌雄各半，2月

龄，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物许可证号 SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，相对湿度45%～

55%，室温（23±2）℃，自由摄食饮水。

1.2 药物香砂六君子汤（生晒参、茯苓、麸炒白术、姜半夏、木香、砂仁、陈皮、甘草、生姜），饮片均购自兰州复兴厚药材有限责任公司。生晒参、麸炒白术、茯苓、陈皮、姜半夏、砂仁、木香、生姜、甘草按6∶

12∶12∶5∶6∶5∶4∶12∶4 比例配制[11]。加 10 倍蒸馏水浸泡2 h后常规煎煮1 h，滤出药渣，保存药液，药渣再加8倍蒸馏水煎煮45 min，混合 2次药液，常

压下浓缩至1 mL药液含原药材2 g。置于 4 ℃冰箱保存，使用时稀释至所需浓度。维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，批号 20160518；MNNG，梯希爱化成工业发展有限公司，批号 75F7I-TF；雷尼替丁，广东华南药业集团有限公司，批号151101。

1.3 主要试剂与仪器

VEGF酶联免疫试剂盒，上海将来实业股份有限公司，批号 201811；总 RNA 抽提试剂 Trizol，美国Life Technologies 公司，批号 152104；PCR 反转录试剂盒，美国 Promega 公司，批号 00435083；实时荧光定量 PCR 扩增试剂盒，美国 Promega 公司，批号

0000227638；彩虹 Marker，北京索莱宝生物科技有限公司，批号 00580081；GAPDH，美国 Gene Tex 公司，批号 130201；Ant-PTEN Antibody，美国 Abcam 公司，批号 GR62840-23 ； Ant-pan-AKT Antibody ，美国Abcam 公司，批号 GR3192605-11；Ant-PI3K antibody，美国 Abcam 公司，批号 GR3192684-9；IgG（H+L），美国 Immunoway 公司，批号 B0201。VELOCITY 18R高速台式低温离心机（澳大利亚 Dynamically 公司），

XYJ80-2 离心机（广东塘厦骏越机电设备厂）， BIOMATE 3S 核酸蛋白测定仪（美国 BIO-RAD），

S1000TM反转录仪（美国 Bio-Rad），CFX96TM Optics Module PCR 仪（美国 Bio-Rad），HH-4 数显恒温水浴箱（江苏省金坛市友联仪器研究所），JY-SPAT 电泳槽（美国 Bio-Rad），Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统（美国 Bio-Rad），电子计时器（Gene Tex）。

1.4 造模大鼠给予常规饲料及双蒸水适应性饲养 7 d，按随机数字表法将120 只大鼠分为空白组（20只）和造

模组（100 只）。每日 8:00 空白组大鼠给予1 mL/100 g生理盐水灌胃，每日 9:00 给予定量维持饲料，给予双

蒸水供大鼠每日自由饮用。造模组大鼠参照文献[12]方法，采用综合法造模。①使用 DMSO 作为溶剂，将 MNNG固体溶解，配制成20%MNNG 溶液，置于

4 ℃冰箱避光保存；②将配制好 MNNG 溶液与水按

1∶2000 比例配制，给予大鼠自由饮用，大鼠饮水瓶采用锡箔纸包裹避光；③将雷尼替丁溶解于85%NaCl溶液当中，按 0.03 g/kg大鼠体质量灌胃；④采用饥饱

失常喂养法：2d足量喂养，1 d禁食不禁水。连续造模 16 周。待大鼠CAG 造模 8 周后，2周为 1个周期，随机抽取大鼠，取大鼠胃组织做病理检查，评价CAG模型复建是否成功。

1.5 分组及给药

造模 16周后病理切片显示CAG大鼠模型成功，按随机数字表法将成模大鼠分为模型组、维酶素组和香砂六君子汤高、中、低剂量组，每组 16 只。模型组和空白组每日按 10 mL/kg 蒸馏水灌胃，维酶素组每日按 0.30 g/kg 维酶素灌胃（相当于60 kg 成人每日剂量的 6 倍），香砂六君子汤高、中、低剂量组每日按 24、12、6 g 原药材/kg灌胃（相当于60 kg 成人每日剂量的 12、6、3倍）。等效剂量按人与动物体型系数折算，给药体积2 mL/100 g，每日 1 次，连续 120 d。

1.6 标本采集与检测大鼠于末次灌胃后禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉脱臼处死大鼠，解剖，取出胃组织，沿胃大弯剪开，生理盐水漂洗去除胃内容物。部分组织存放于

4%多聚甲醛以备后续HE染色行病理组织学评估；另

一部分置冻存管中，立即放入-80 ℃超低温冷冻冰箱备用，以备后续采用 RT-PCR 和 Western blot 分别检测大鼠胃组织 PTEN、PI3K、AKT 基因及蛋白表达。

1.7 ELISA检测大鼠胃组织血管内皮生长因子含量将试剂盒和待测血清平衡至室温，稀释准备对照品和洗涤液，按要求加样、温育、洗涤、温育、洗涤、显色、终止，酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度，并绘制标准曲线，计算样品浓度。严格按 ELISA 试剂盒说明书进行操作。

1.8 RT-PCR检测大鼠胃组织磷酸酶张力蛋白同源物基因、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B基因表达

采用 Trizol 法提取总RNA，测定其 OD260/OD280均在 1.8～2.0，反转录为 cDNA，PCR 扩增 PTEN、

PI3K、AKT 基因片段。引物设计：从NCBI 基因库中查询目标基因ID及序列，引物由 TAKARA 公司宝生物工程大连有限公司设计和合成。β-Actin引物序列：上游 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游

5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，扩增片段长度 150 bp；PTEN 引物序列：上游 5'-CCAATGGCTA

AGTGAAGACGACAA-3' ，下游 5'-CATAGCGCCT

CTGACTGGGAATA-3'，扩增片段长度 197 bp；PI3K引物序列：上游5'-CTGGAGAGCTTGGAGG ACGA-3'，下游 5'-TCGCAAGAACCAGAATAAGAAGTG-3'，扩增片段长度 159 bp ； AKT 引物序列：上游

5'-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA-3'，下游 5'-GCCC

TTGCCCAGTAGCTTCA-3'，扩增片段长度 126 bp。本实验选择 β-actin 作为内参基因，同一种基因在模板进行 6次平行实验，每次平行试验设置3个复孔，记录目的基因和 β-actin 的 Ct 值。运用 ΔΔCt 法分析数据，计算相对表达量，检测 β-Actin 及目的基因Ct 值。

ΔCt1＝测试组目的基因 Ct值－测试组 β-actin Ct 值，

空白组

表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠胃组织PTEN mRNA 及

蛋白表达均有升高趋势，PI3K、AKT mRNA 及蛋白表达有降低趋势，其中香砂六君子汤高、中剂量组大鼠胃组织 PTEN mRNA及蛋白表达均显著升高，高剂量组大鼠胃组织 PI3K、AKT mRNA及蛋白表达均显著降低，差异有统计学意（P＜0.01）。结果见表 2、图 2。

—

随机单盲对照临床试验设计，将80 例 CAG患者随机分为 2组，治疗组予化浊解毒方治疗，对照组予阿拉坦五味丸治疗，结果表明化浊解毒方能显著降低血清及胃黏膜组织 AKT、受体酪氨酸激酶（c-Met）的表达，说明调控 AKT、c-Met 的表达水平能对慢性胃炎产生作用。江明礼等[22]构建幽门螺杆菌（Hp）感染慢性胃炎动物模型，给予苗药头花蓼治疗后，采用Western blot 和 RT-PCR 技术检测大鼠胃黏膜组织，结果显示苗药头花蓼可能通过上调 PTEN 表达、抑制AKT表达，从而改善Hp引起的胃黏膜炎症。

本研究结果显示：与空白组比较，模型组大鼠胃组织 PTEN 基因及蛋白表达显著降低，提示 CAG 发病与大鼠胃组织PTEN基因及蛋白表达降低有关；与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组大鼠胃组织PTEN 基因及蛋白表达显著升高，提示香砂六君子汤通过上调 CAG 大鼠胃组织 PTEN 基因及蛋白表达而治疗CAG。与空白组比较，模型组大鼠胃组织VEGF含量及 AKT、PI3K 基因及蛋白表达显著升高，提示CAG发病与胃组织VEGF 含量及 AKT、PI3K 基因及蛋白表达升高有关；与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组大鼠胃组织VEGF 含量及 AKT、PI3K 基因及蛋白表达显著降低，提示香砂六君子通过下调 CAG大鼠胃组织 VEGF 含量及 AKT、PI3K 基因和蛋白表达，调节增殖和凋亡平衡机制，从而改善CAG病变。

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（收稿日期：2019-07-05）

（修回日期：2019-07-20；编辑：华强）