扶正化瘀方对脂多糖诱导的RAW264.7 巨噬细胞M1型炎性极化JNK通路的影响

张满1，胡旭东2，黄恺1，陶艳艳1，彭渊1，刘成海 1，3，4

1.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，上海 201203；

2.上海中医药大学基础医学院，上海 201203；

3.上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203；

4.上海市中医临床重点实验室，上海 201203

摘要：目的 观察扶正化瘀方对脂多糖（LPS）诱导的M1 型 RAW264.7 巨噬细胞一氧化氮合酶（iNOS）基因和一氧化氮（NO）分子过表达的影响，探讨其可能的抗炎机制。方法 采用 LPS 刺激小鼠 RAW264.7 巨噬细胞，建立M1型巨噬细胞炎性细胞模型，分别给予扶正化瘀方50、100、200 μg/mL 和 10 nmol/L JNK 蛋白抑制剂 SP600125 进行孵育。Griess 法检测炎症介质NO 含量，RT-PCR 检测炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和 iNOS 基因表达，Western blot 检测 iNOS 蛋白表达和MAPK信号通路中 JNK、p38、ERK蛋白的磷酸化水平。结果 与 LPS比较，扶正化瘀方和 SP600125 均显著降低巨噬细胞中NO分泌（P＜

0.01）和 iNOS 蛋白表达（P＜0.01），降低 MAPK 信号通路 JNK 蛋白的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01）；扶正化瘀方对炎症因子 IL-6、TNF-α 的基因表达及MAPK 信号通路 ERK、p38 蛋白的磷酸化水平无明显影响。结论 扶正化瘀方可能通过抑制 JNK 蛋白的磷酸化而抑制 iNOS 基因过表达，最终减少 NO 的生成，从而抑制 RAW264.7 巨噬细胞M1型极化，发挥抗炎作用。关键词：扶正化瘀方；巨噬细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶；MAPK信号通路；JNK信号通路

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)03-0043-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201909314 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Fuzheng Huayu Prescription on LPS-induced Inflammatory M1 Polarization of RAW264.7 Macrophages Through JNK Pathway

ZHANG Man1, HU Xudong2, HUANG Kai1, TAO Yanyan1, PENG Yuan1, LIU Chenghai1,3,4

1. Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Shanghai 201203, China; 4. Shanghai Key Laboratory of Clinical Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Abstract: Objective To explore the effects of Fuzheng Huayu Prescription on iNOS gene overexpression and NO overproduction in M1 polarized RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS); To discuss its possible anti-inflammatory mechanism. Methods LPS was used to stimulate mouse RAW264.7 macrophages to establish an inflammatory M1 macrophage model, and Fuzheng Huayu Prescription (50, 100, 200 μg/mL) and 10 nmol/L JNK inhibitor SP600125 were incubated respectively. Inflammatory mediator NO production was measured by Griess method. The mRNA expressions of inflammatory cytokines IL-6, TNF-α and iNOS were detected by Real-time RT-PCR. iNOS protein expression and the phosphorylation levels of key proteins in MAPK signaling pathway, namely p-JNK, p-p38 and p-ERK were detected by Western blot. Results Compared with LPS, Fuzheng Huayu Prescription and SP600125 could significantly reduce the overproduction of NO (P<0.01), the overexpression of基金项目：国家自然科学基金重点项目（81730109）通讯作者：刘成海，E-mail：chenghailiu@hotmail.com

iNOS protein (P<0.01) and the phosphorylation levels of JNK protein (P<0.05, P<0.01) in MAPK signaling pathway in macrophages. Fuzheng Huayu Prescription had no significant effect on the mRNA expressions of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in LPS-induced macrophages, and the phosphorylation levels of ERK and p38 proteins in MAPK signaling pathway. Conclusion Fuzheng Huayu Prescription exerts its anti-inflammatory-M1 - polarization effect on RAW264.7 macrophages through inhibiting iNOS gene overexpression and NO overproduction by repressing JNK phosphorylation.

Keywords: Fuzheng Huayu Prescription; macrophage; NO; iNOS; MAPK signaling pathway; JNK signaling pathway

慢性肝病进展中，肝脏炎症（inflammation）→纤维化（fibrosis）→癌症（cancer）所构成的 IFC 轴线

越来越被人们重视[1]，肝内 M1 型巨噬细胞炎性极化是肝纤维化发生的始动因素和肝纤维化进展的促进要素。因此，抑制肝脏中肝内M1型巨噬细胞炎性极化，从而减轻肝脏炎症损伤，是肝纤维化乃至肝癌防治中的重要目标。扶正化瘀方由上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所研制，临床广泛用于抗肝纤维化。研究表明，扶正化瘀方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化 6个月后，在逆转肝纤维化的同时明显改善肝组织

炎症[2]，但其抗炎分子机制尚未阐明。我们前期研究发现，扶正化瘀方能显著抑制M1型巨噬细胞中炎症介质一氧化氮（NO）生成。在 M1 型巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）催化 L-精氨酸分解产生 NO[3]，而 MAPK 信号通路则是调控 iNOS 基因表

达的重要信号通路[4]。本研究拟探讨扶正化瘀方通过调控MAPK信号通路减少NO生成从而抑制M1型巨噬细胞炎性极化的可能抗炎机制。

实验材料

药物扶正化瘀方浸膏粉，上海黄海制药有限责任公司，批号180206。质控标准：褐色粉末，味苦、涩；每克含发酵草菌粉以腺苷不少于1000 g/批，丹参以丹参素钠不少于 3000 g/批，丹酚酸 B不少于 5000 g/批，水分少于8.0%，需氧菌总数不超过 1000 cfu/g，霉菌、酵母菌总数不超过100 cfu，大肠埃希菌不得检出。

1.2 细胞株及主要试剂

RAW264.7 巨噬细胞株，购自中国科学院干细胞库（编号 SCSP-5036）。DMEM 高糖培养基、胎牛血清（美国 Gibco 公司），链霉素、青霉素均（ScienCell

公司），CCK8细胞试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），二甲基亚砜（DMSO，Corning 公司），脂多糖（LPS，美国 Sigma 公司），JNK 抑制剂 SP600125， （MCE 公司），总 RNA 提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），反转录试剂盒（货号RR047A，

TaKaRa 公司），扩增试剂盒（货号 RR420A，TaKaRa公司），BCA 蛋白定量试剂盒（货号 23227，Pierce化学公司），iNOS 抗体（Abcam 公司），p-JNK、p-ERK和 p-p38 抗体（美国 CST 公司），山羊抗鼠和山羊抗兔的荧光二抗（ LI-COR 公司）， GAPDH 抗体（Proteintech 公司）。

1.3 仪器

Odyssey 红外荧光扫描成像系统，美国 LI-COR公司；垂直板电泳槽、半干电转印系统，美国Bio-Rad

公司；ABIViiA7 型荧光定量PCR 仪，美国 ABI 公司；多功能酶标仪，美国 Bio-Tek 公司。实验方法

细胞培养

将 RAW264.7细胞以合适的浓度接种于10 cm培养皿中，根据实验需要接种不同数量细胞于6、96 孔细胞培养皿中，置于含 10%FBS DMEM 培养基，

37 ℃、5%O2、95%湿度培养箱中培养。传代时吸走部分培养液，留下3～4 mL培养液，用无菌细胞刮板刮拭培养皿表面，将细胞刮落，吹打后接种到新的装有新鲜培养液的培养皿中进行传代。

2.2 CCK8法检测扶正化瘀方细胞毒性

RAW264.7 细胞接种至96孔板，调整细胞数量为

5×104个/孔，细胞种板后，分别加入 2、5、50、100、

200、400、1000 μg/mL不同浓度扶正化瘀方，每个浓度设置6个复孔，将接种好的细胞置于培养箱中孵育

24 h后弃去上清液，每孔加100 μL 10% CCK8 继续培养2h，在波长 450 nm/630 nm处测吸光度，计算细胞存活率，评价扶正化瘀方的细胞毒性。

2.3 细胞分组

体外培养 RAW264.7 细胞接种于6孔板，根据实验需要设计正常组、正常＋扶正化瘀方组、LPS组、

LPS＋扶正化瘀方（50、100、200 μg/mL）组和 JNK抑制剂组，每组设3个复孔。细胞种板后，LPS组和LPS＋扶正化瘀方组给予1 μg/mL LPS刺激，JNK抑制剂组给予10 nmol/L SP600125 刺激，随后LPS＋扶正化

扶正化瘀方对脂多糖诱导的因表达的影响

与正常组比较，LPS 诱导 RAW264.7 巨噬细胞炎症相关因子 iNOS、IL-6 和 TNF-α 基因表达显著

升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与 LPS 组比较，扶正化瘀方各浓度组 IL-6、TNF-α 基因表达无

显变化，但能明显下调 iNOS 基因的表达，差异有

统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），尤以扶正化瘀方

200 μg/mL浓度时最为显著，差异有统计学意义（P＜

0.01）。结果见图 2。