CJI (Traditional Chinese Medicine)
电针对不同阶段SAMP8小鼠学习记忆能力及海马区突触素和突触后致密物-95表达的影响
赵恩聪1，郑家勇2，郭婉清3，洪苗苗1，林岚4，王丰4，董卫国 4
1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；
3.福建省第三人民医院，福建 福州 350108；4.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122摘要：目的 观察电针对不同阶段SAMP8小鼠学习记忆能力及海马区突触素（SYN）和突触后致密物-95
（PSD-95）表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病的最佳时机。方法 SAMP8 小鼠 48只随机分成模型组、
3 月龄电针组、6月龄电针组和9月龄电针组，每组12只，同龄正常老化 SAMR1 小鼠 12只为对照组。电针组均选取“百会”“大椎”“肾俞”，电针频率为2 Hz，每日 1 次，8 d 为 1个疗程，每个疗程间隔2d，共3个疗程。运用 Morris 水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化和 Western blot 检测海马突触相关蛋白 SYN和 PSD-95 的表达。结果 与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，原平台象限停留时间明显缩短，
跨越原平台次数明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），海马区 SYN 和 PSD-95 蛋白表达明显
下降（P＜0.01）；与模型组比较，各电针组小鼠逃避潜伏期明显缩短，原平台象限停留时间明显延长，跨越原
平台次数明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），海马区 SYN 和 PSD-95 蛋白表达均明显升高
（P＜0.01），且均以 3 月龄电针组最显著（P＜0.05，P＜0.01）。结论 电针能提高 SAMP8小鼠学习记忆能力，促进海马区 SYN、PSD-95 蛋白的表达，改善突触功能。
关键词：阿尔茨海默病；电针；学习记忆；突触素；突触后致密物-95；SAMP8小鼠
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)03-0048-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908294 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability and Expressions of Hippocampal Synaptophysin and PSD-95 in SAMP8 Mice at Different Stages
ZHAO Encong1, ZHENG Jiayong2, GUO Wanqing3, HONG Miaomiao1, LIN Lan4, WANG Feng4, DONG Weiguo4
1. College of Acupuncture and Moxibustion, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;
2. College of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;
3. The Third People’s Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350108, China; 4. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China Abstract: Objective To observe the effects of electroacupuncture on learning and memory ability and expressions of synaptophysin (SYN) and postsynaptic density-95 (PSD-95) in the hippocampus of SAMP8 mice at different stages; To explore the optimal time of electroacupuncture in the treatment of Alzheimer disease (AD). Methods Totally 48 SAMP8 mice were randomly divided into model group, 3-month-old electroacupuncture group,
6-month-old electroacupuncture group and 9-month-old electroacupuncture group, with 12 mice in each group. 12
SAMR1 mice of the same age and normal aging were set as control group. In the electroacupuncture group, Baihui
(GV20), Dazhui (GV14) and Shenshu (BL23) acupoints were selected. The electroacupuncture frequency was 2 Hz, once a day, and 8 days was a course of treatment, with a course interval of 2 days. There were 3 courses of treatment in total. Morris water maze experiment was used to test the learning and memory ability of mice in each group, and the expression of hippocampal synapse related proteins SYN and PSD-95 was measured by immunohistochemistry
基金项目：国家自然科学基金（81973923）；福建省自然科学基金（2017J01541）；福建省中医药科研项目（2017FJZYJC102）；
福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目（2017-ZQN-63）
通讯作者：董卫国，E-mail：fjdwg601@163.com
and Western blot. Results Compared with the control group, the escape latency of the model group was significantly prolonged, the residence time of the original platform quadrant was significantly shortened, and the number of crossing the original platform was significantly reduced, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). The expression of SYN and PSD-95 protein in hippocampus of model group significantly decreased (P<0.01). Compared with the model group, the escape latency of the mice in each electroacupuncture group was significantly shortened, the residence time of the original platform quadrant was significantly prolonged, and the number of crossing the original platform significantly increased, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). The expressions of SYN and
PSD-95 protein in hippocampus of mice in each electroacupuncture group significantly increased (P<0.05, P<0.01), and were most significant in the 3-month-old electroacupuncture group (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice, promote the expressions of SYN and PSD-95 in the hippocampus, and improve the synaptic function.
Keywords: Alzheimer disease; electroacupuncture;
density-95; SAMP8 mice
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种起病隐匿且与年龄相关的退行性神经系统疾病，主要表现为进行性认知功能退化、记忆丧失和行为障碍等。其早期突出的病理特征为神经元的丢失与突触损
伤[1-2]。近年来，突触功能在 AD防治中备受重视，保持突触的稳态平衡可能是 AD 治疗的新策略[3]。研究表明，电针能增强SAMP8 小鼠突触功能[4-5]，但目前关于电针治疗AD时机的研究报道较少。故本实验对
3、6、9 个月不同月龄 SAMP8 小鼠进行电针治疗，运用 Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化和 Western blot检测与突触可塑性密切相关的突触素（ synaptophysin ， SYN ）和突触后致密物-95 （postsynaptic density-95，PSD-95）的表达，从突触可塑性角度探讨电针治疗AD的时机。实验材料
动物
SAMP8
48 只及 SAMR 小鼠 12 只，3月龄，
20～25 g，北京大学医学部（实验动物
SCXK（京）2011-0012。饲SPF
1 22～24
50%～60%，明暗周期 12 h，自由摄食饮水。learning and memory; synaptophysin; postsynaptic
Bio-Rad 图像分析系统。G6805-Ⅰ电针治疗仪，青岛
鑫升实业有限公司；0.25 mm×15 mm华佗牌无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。
实验方法
分组及干预
将 只 SAMP8 小鼠随机分为模型组、3月龄电
月龄电针组和9月龄电针组，每组12 只，另取 只 小鼠作为对照组。电针组采用自制网兜固定小鼠，选取“百会”“大椎”“肾俞”，参照
《实验针灸学》[6]取穴。“百会”位于小鼠顶骨正中， “大椎”位于背部第 7 颈椎与第 1 胸椎间，“肾俞”位于第 2腰椎下两旁。操作方法：“百会”向前斜刺
2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“肾俞”稍向内斜刺 3～4 mm，其中“大椎”“肾俞”给予电针刺激， “肾俞”双侧隔日交替。连续波，频率2 Hz，电流强度以引起小鼠后肢肌肉轻微颤动而不嘶叫为宜。每次
20 min，每日 1 次，8 d 为 1个疗程，每个疗程间隔
2 d，共 3个疗程。全部小鼠由3月龄饲养至9月龄，模型组和对照组除不进行电针治疗，其余抓取和固定方式相同，水迷宫实验后统一取材。
2.2 Morris 水迷宫实验治疗结束后，均在 10 月龄运用 Morris 水迷宫视频分析系统检测小鼠空间学习记忆能力。定位航行实验：将平台置于第三象限中间，水面高于平台约1 cm，分别从 4 个象限筒壁中点放入小鼠，记录小鼠 90 s内找到平台时间，即为逃避潜伏期，连续记录 5 d。空间探索实验：第6日撤掉平台，将小鼠从第一象限放入，记录90 s内小鼠跨越原平台时间及次数。
2.3 免疫组化检测突触素和突触后致密物-95蛋白表达每组取6只小鼠，麻醉后灌流固定。取全脑修块
后放入4%多聚甲醛内，固定 24～48 h。将脑组织石蜡包埋，切片，制片。分别加入SYN 抗体（1∶700）和 PSD-95 抗体（1∶200），湿盒孵育过夜。加入生物素标记的羊抗兔IgG 二抗，DAB显色，封片。用PBS替一抗作阴性对照。镜下观察每张玻片海马 CA1
3个阳性染色区域，以棕黄色作为阳性判断标准，同一光源、光圈、色彩饱和度和对比度等相同条件，拍照采集图片。用 Motic Med 6.0 数码医学图像析系统对海马 CA1 区 SYN 及 PSD-95 图片进行分析，计算SYN 及 PSD-95 的平均光密度（MOD）值。
2.4 Western blot 检测突触素和突触后致密物-95 蛋白表达
每组取6只小鼠进行麻醉，灌注后快速断头取脑，
分离出完整海马，-80 ℃保存，称海马湿重，裂解后取上清液， BCA 法测上清液浓度。蛋白样品用
10%SDS-PAGE 进行电泳，300 mA转蛋白质至PVDF膜上。封闭 2h 后，加入 SYN 抗体（1∶8000）、PSD-95
抗体（1∶1000）、抗小鼠 β-actin（1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤；加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室温孵育2h，TBST洗涤。配制显色液并覆PVDF 膜1 min 后进行图像扫描，Bio-Rad图像分析系统分析。以 β-actin 为内参，计算目的蛋白相对灰度。统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，水迷宫定位航行空间探索结果采用重复测量方差分析，其他结果采用方差分析，组间比较采用LSD 法。P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果
Morris
模型组月龄电针组注：红色箭头为 表达区域