CJI (Traditional Chinese Medicine)
铁皮石斛根、茎和叶中内生真菌分离与鉴定
雒晓芳1，许淑娟2，陈丽华3，王冬梅1，张璐1，费孝桐2，赵梓彤 2
1.西北民族大学实验教学部，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；
3.西北民族大学化工学院，甘肃 兰州 730030
摘要：目的 分离鉴定铁皮石斛的内生真菌，为铁皮石斛的开发利用提供依据。方法 以多种培养基为基础分离培养基，分别从铁皮石斛的根、茎和叶中分离内生真菌，采用平板划线法对分离得到的菌株进行纯化，并观察其菌落形态。利用形态学、生理生化分子特性及分子生物学手段鉴定内生真菌。结果 分离得到7株铁皮石斛内生真菌，根、茎和叶中的真菌种类和数量各不相同，仅X1菌株同时存在于根、茎和叶部位。通过对性状稳定的3株真菌进行分子生物学鉴定，XJ1与链格孢菌 Alternaria sp.的 16S rDNA 序列有99%的同源性，
XY6 与链格孢菌 Alternaria sp.的 16S rDNA 序列有 93%的同源性，X1 菌株与好食链孢霉菌 Neurospora africana 的 16S rDNA 序列有99%的同源性。结论 本研究分离并鉴定了铁皮石斛根、茎和叶中的内生真菌，可为铁皮石斛资源的开发利用提供依据。
关键词：铁皮石斛；内生真菌；分离；鉴定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)03-0057-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201810125 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Isolation and Identification of Endophytic Fungi in Roots, Stems and Leaves of Dendrobium officinale
LUO Xiaofang1, XU Shujuan2, CHEN Lihua3, WANG Dongmei1, ZHANG Lu1, FEI Xiaotong2, ZHAO Zitong2
1. Center of Experiment, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China;
2. College of Life Science and Engineering, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China;
3. School of Chemical Engineering, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China
Abstract: Objective To isolate and identify the endophytic fungi in different tissues of Dendrobium officinale; To provide basis for development and utilization of Dendrobium officinale. Methods The endophytic fungi was isolated from the roots, stems and leaves of Dendrobium officinale by using various basal culture media. The isolated strains were purified by the plate streaking, and their colony morphology was observed. Endophytic fungi were identified by morphological, physiological and biochemical molecular characteristics and molecular biological methods. Results Seven strains of endophytic fungi were isolated. The quantity and species of microorganisms differed in roots, stems and leaves. Only X1 existed in roots, stems and leaves at the same time. Three strains of fungi with stable characters were identified by molecular biology. By molecular bioassay of three fungi with stable traits,
XJ1 had 99% homology with the 16S rDNA sequence of Alternaria sp.; XY6 had 93% homology with the 16S rDNA sequence of Alternaria sp.; X1 strain had 99% homology with the 16S rDNA sequence of Neurospora africana. Conclusion This study isolates and identifies endophytic fungi from the roots, stems and leaves of Dendrobium officinale, which can provide a basis for the development and utilization of Dendrobium officinale resources.
Keywords: Dendrobium officinale; endophytic fungi; isolation; identification铁皮石斛 Dendrobium officinale 为兰科石斛属多年生草本植物，不仅是传统的珍贵中药材，也具有很
基金项目：西北民族大学基本科研业务费专项（31920190052）；
西北民族大学开放项目（2019年）
通讯作者：陈丽华，E-mail：673126749@qq.com高的观赏价值。铁皮石斛广泛分布于安徽、浙江、云南、广西、广东等地，其生长缓慢，自身繁殖力低，需要与内生菌共生才能完成生活史。
微生物与植物体相互作用关系由来已久，大多数植物体的根、茎、叶都分布着数量和种类众多的微生物[1]。微生物与植物体的相互作用对植物的生长发育
具有重要作用。内生菌作为植物微生态系统中的天然组成部分，对植物具有多方面的积极作用。在生物防治上，植物内生菌系统地分布于植物体内，有充分的碳源和氮源的供应，比暴露于外界的恶劣环境中更有
利于发挥作用[2]。铁皮石斛含有多种内生真菌，一些内生真菌能有效促进其生长发育，并在组织和宿主中表现出一定的
差异[3]。铁皮石斛内生真菌是筛选新活性物质的重要
资源[4-10]。本试验以铁皮石斛根、茎和叶为试验材料，分离铁皮石斛不同部位的菌株，对其进行比较鉴别，为铁皮石斛的进一步开发利用提供试验依据。材料在云南省普洱市宁洱县五里坡选取生长优良、表面无病虫害的仿野生生长3年以上的铁皮石斛整个植株，经西北民族大学生命科学与工程学院郭鹏辉鉴定为铁皮石斛 Dendrobium officinale。
培养基购自杭州微生物有限责任公司，批号
20180706-00。①麦芽汁琼脂培养基：氯霉素 0.1 g，麦芽膏粉 30 g，琼脂 15 g，加水定容至 1L，121 ℃高压灭菌 30 min。②马铃薯琼脂糖培养基：土豆冲洗干净并去皮，取200 g切成小块，加入纯水1 L，煮沸 30 min，补纯水至 1 L。在滤液中加入10 g琼脂，煮沸后加入20 g 糖，溶解，补水，121 ℃灭菌 30 min。③高盐察氏培养基：氯化钾 0.5 g，硫酸亚铁 0.01 g，氯化钠 60 g，蔗糖 30 g，琼脂 20 g，加水定容至1 L，
121 ℃高压灭菌30 min。④营养琼脂培养基：牛肉膏
1 g，酵母膏2 g，蛋白胨 5g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，加水定容至1L，调 pH 值为 7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。⑤LB固体培养基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5g，NaCl 5 g，琼脂粉 15 g，加水定容至
1 L，调 pH值至 7.4，加热溶解，121 ℃高压灭菌30 min。盐酸、蔗糖、氢氧化钠、无水乙醇、异丙醇、
10%SDS、双氧水、1×TAE（pH 8.0）、1%氯化汞、亚硫酸钠、硫酸双氢链霉素、青霉素G 钾、10 mg/mL Rnase（Sigma）、PCR 试剂盒、乳酸石炭酸棉蓝染色
液、5%石炭酸复红染色液。切成 2～3 mm薄片，弃去两头切片，选取中间切片，按照插片法将切片等距离均匀分别放置于含链霉素
（50～100 mg/L）和青霉素（100～300 mg/L）的 5种固体培养基（麦芽汁琼脂培养基、高盐察氏培养基、营养琼脂培养基、LB 固体培养基、马铃薯琼脂糖培
养基）上，3～4片/皿。于 26 ℃黑暗条件下培养5～
10 d，待切片周围长成肉眼可见的菌落时，以平板划线法用接种环立即挑取单个菌落移入另一个平板上，四区划线分离真菌，继续培养。
2.1.2 复筛将初筛获得的优势菌种用平板划线法进行纯化分离，连续富集培养3次。当富集培养均无杂菌出现，用平板划线法进行菌株的分离纯化，重复3次。肉眼观察培养特征，选择生长优良的菌株。将得到的单菌
株接种到斜面上，26 ℃培养 3～5 d，置于 4 ℃冰箱保存备用。
2.2 菌种鉴定
2.2.1 形态学鉴定
用 5种不同的固体及对应的液体培养基经初筛、富集培养及分离纯化，从叶中分离出5株真菌，从茎中分离出2株真菌，从根中分离出2株真菌，共得到
7株铁皮石斛优势内生真菌，分别编号为XY6、XY4、
XY1、XY5、XJ1、XG2、X1。菌落形态见图1、表 1。将纯化的菌株用 0.5%石炭酸复红染色液或乳酸石炭酸棉蓝染色液简单染色后观察形态。结果见图2。
XJ1、X1 的 16S rDNA 核酸序列输入 NCBI Blast （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），与已知的菌株序列进行比对，分析其亲缘和进化关系，并用
MEGA5.1软件绘制菌株的系统进化树，结果见图3～图 6。结果表明，XJ1 与链格孢菌 Alternaria sp.的 16S rDNA 序列有 99%的同源性， XY6 与链格孢菌Alternaria sp.的 16S rDNA 序列有 93%，X1 菌株与好食链孢霉菌 Neurospora africana 的 16S rDNA 序列有
99%的同源性。结合形态学及分子生物学染色结果综合分析，将 XJ1 与 XY6 菌株均归属于链格孢菌属Alternaria sp. ， X1 与好食链孢霉菌 Neurospora africana 具有较近的遗传距离。