维吾尔药睡莲花基原及质量控制研究

刘新桥1，沙拉麦提•艾力2，斯拉甫•艾白3，汪波4，陈亚飞1，梅之南 1

1.中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074；2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆 乌鲁木齐 830002；

3.新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所，新疆 乌鲁木齐 830049；4.湖北省药品监督检验研究院，湖北 武汉 430075摘要：目的 通过分析睡莲花样品的基原及特征性成分烟花苷和紫云英苷含量，为睡莲花的基原确认和质量控制提供依据。方法 以核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）为主体条形码序列进行基原鉴定。采用HPLC 测定烟花苷和紫云英苷含量，Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为0.2%磷酸溶液（含1.0%四氢呋喃），梯度洗脱（0～65 min，15%→11%A；65～75 min，11%→

25%A；75～80 min，25%→15%A；80～90 min，15%A），流速 1.0 mL/min，检测波长 350 nm，柱温 30 ℃。结果 ITS2 序列可将睡莲花与其近源物种很好区分。特征性成分烟花苷和紫云英苷分离度良好，供试品溶液在 24 h内稳定；烟花苷回归方程为 Y＝31.09X－12.142（r＝0.999 9），紫云英苷回归方程为 Y＝13.304X－11.25

（r＝0.999 5），均具有良好的线性关系；重复性试验RSD＜2.0%；烟花苷和紫云英苷平均回收率分别为 99.44%和 98.88%。结论 DNA条形码可准确鉴定维吾尔药睡莲花的基原，结合特征性成分烟花苷和紫云英苷含量测定，可较全面控制睡莲花的质量。

关键词：睡莲花；DNA条形码；烟花苷；紫云英苷；含量测定

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)12-0059-05

DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202004143 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Original Plant and Quality Control of Uygur Medicine Nymphaeae Flos

LIU Xinqiao1, SHALAMAITI Aili2, SILAFU Aibai3, WANG Bo4, CHEN Yafei1, MEI Zhinan1

1. School of Pharmaceutical Sciences, South-central University for Nationalities, Wuhan 430074, China; 2. Xinjiang Institute for Food and Drug Control, Urumqi 830002, China; 3. Xinjiang Institute of Traditional Uyghur Medicine,

Urumqi 830049, China; 4. Hubei Institute for Drug Control, Wuhan 430075, China

Abstract: Objective To comprehensively analyze the original plant of Nymphaeae Flos and the contents of two main compounds (nicotiflorin and astragalin); To provide the evidence for the origin as certainment and quality control of Nymphaeae Flos. Methods The second inside transcription silent region (ITS2) was used as the main barcodes sequence to identify the original plant. The contents of nicotiflorin and astragalin were determined by HPLC on Agilent ZORBAX SB-Aq C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with the mobile phase of methanol (A)-0.2% phosphoric acid solution (containing 1.0% tetrahydrofuran) (B) in a gradient mode (0-65 min, 15%→11%A; 65-75 min,

11%→25%A; 75-80 min, 25%→15%A; 80-90 min, 15%A); the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelength was set at 350 nm; the column temperature was 30 ℃. Results The system evolutionary tree showed that ITS2 sequence could make it easy to distinguish Nymphaeae Flos from the related species. Under the established chromatographic conditions, good separation and linearity were obtained for the nicotiflorin and astragalin. The regression equations were Y=31.09X-12.142 (r=0.999 9) and Y=13.304X-11.25 (r=0.999 5); the RSD of the replicate test was less than 2.0%; the average recovery rates were 99.44% and 98.88%. Conclusion DNA barcode can identify Nymphaeae Flos accurately. Combining with the content determination of the characteristic compounds of nicotiflorin and astragalin, the quality of Nymphaeae Flos can be controlled comprehensively.

Keywords: Nymphaeae Flos; DNA barcode; nicotiflorin; astragalin; content determination

基金项目：国家重点研发计划（2018YFC1708004）

通讯作者：梅之南，E-mail：meizhinan@163.com

睡莲花为睡莲科植物雪白睡莲 Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾，主要分布于我国新疆伊犁、

阿勒泰和博湖地区[1]，以及巴基斯坦、印度等国。睡莲花为维吾尔医习用药，称为“内鲁帕尔”，具有降热止咳、益心护脑、安神止痛、祛乃孜来功效，临床主要用于治疗感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛或热证引起的头痛、热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症，其标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准•

维吾尔药分册》[2]。现代药理研究表明，睡莲花具有

抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性[3-6]。据报道，黄酮类成分烟花苷和紫云英苷是睡莲花主要的特征

性成分[7]。目前，部颁标准仅收载睡莲花的性状及显微鉴别方法，而传统鉴别方法很难确定药材基原。鉴于此，本研究收集 19 批市售睡莲花样品，以核糖体DNA 第二内部转录间隔区（ITS2）为主体条形码序列进行鉴定，并对药材性状特征进行分析，采用HPLC测定特征性成分烟花苷和紫云英苷含量，为全面评价维吾尔药睡莲花的质量提供依据。1 仪器与试药

Bio-Rad T100PCR 仪，Bio-Rad 公司；EPS-301 2 方法与结果

2.1性状特征与鉴别雪白睡莲呈圆锥形或长圆形，花蕾长2.5～4 cm，直径约2 cm，花托略呈方形；花萼4枚，革质，长卵状披针形，表面灰绿色或棕黄色；剥去花萼可见白色

凝胶电泳仪，美国 Amersham 公司；MM400球磨仪，德国 Retsch 公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器），美国 Agilent 公司；Agilent ZORBAX SB-Aq

C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国 Agilent公司；SYZF 10L型超纯水制造系统，成都渗源科技

有限公司；CP214电子天平，奥豪斯仪器上海有限公

司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

快捷型植物基因组提取试剂盒（DP321，天根生化科技有限公司），鉴别引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， PCR 扩增及测序引物正向

5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’、反向 5’-GAC

GCTTCTCCAGACTACAAT-3’。烟花苷对照品（批号

180603，纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司），紫云英苷对照品（批号 180509，纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司），甲醇（美国TEDIA，色谱纯），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），超纯水（实验室自制）。睡莲花样品于 2017 年 4 月－

2018 年 7月于新疆全区、云南、湖北及荷兰、巴基斯坦等地收集，见表1。

花瓣 15～25枚，卵圆形；花药线形，长约10 mm，花丝扁平，几与花药等长；子房球形或椭圆形，无花柱或极短，柱头具6～14辐射线；气微，味淡。

白睡莲本种与雪白睡莲主要区别为花托呈圆柱形；柱头具 14～20 辐射线。

柔毛齿叶睡莲本种与雪白睡莲主要区别为萼片矩圆形；花瓣 12～14 枚，先端圆钝，具 5 纵条纹；柱头具 12～15辐射线，具附属物。

睡莲本种与雪白睡莲主要区别为花瓣宽披针形、长圆形或倒卵形；花药条形，长3～5 mm；柱头具 5～

8辐射线。雪白睡莲、白睡莲、柔毛齿叶睡莲、睡莲的干燥花在性状上有一定差异，但区别较小，部分品种具有连续的数量性状特征，且干花的辐射线等特征不易观察区分，不宜完全凭借性状特征进行基原鉴定。

2.2 DNA条形码分子鉴定

2.2.1 模板DNA 提取、PCR扩增及产物检测

按 2015 年版《中华人民共和国药典》四部通则

9107“中药材 DNA条形码分子鉴定法”。利用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，采用NanoDrop 2000 （ Thermo Scientific ， USA ）测定

OD260/OD280比值及DNA 浓度。PCR 反应体系 30 μL，包括 10×PCR 缓冲液3 μL、二氯化镁（25 mmol/L）

2.4 μL、dNTP（10 mmol/L）0.6 μL、鉴别引物（30 μmol/L）各 0.5 μL、高保真 Taq DAN 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、模板 l μL、无菌超纯水 21.8 μL。反应参数：95 ℃预变性4 min，循环反应（95 ℃、30 s，55～58 ℃、30 s，

72 ℃、30 s）30 次，72 ℃延伸5 min。PCR 产物纯化后使用 ABI3730XL 测序仪双向测序，测序峰图利用 CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，USA）校对拼接，所有序列用 MEGA6.05 软件进行分析及ClustalW 多序列比对，并用邻接法（NJ）构建系统进化树，采用 bootstrap（1000 次重复）检验各分支支持率。为进一步对物种进行准确鉴定，采用 BLAST 局部比对法，通过 GenBank 数据库（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）对所获 ITS2 序列进行检索，设置E值为 1×10-10。

2.2.2 睡莲花及其近源物种系统进化树鉴别

基于 ITS2 序列构建的包含睡莲科睡莲属睡莲Nymphaea tetragona、白睡莲 Nymphaea alba、雪白睡莲 Nymphaea candida、柔毛齿叶睡莲 Nymphaea lotus var. pubescens、延药睡莲 Nymphaea nouchali 及睡莲科芡属芡实 Euryale ferox、萍蓬草属欧亚萍蓬草Nuphar lutea、萍蓬草 Nuphar pumila 等物种的NJ 系统进化树见图 1。睡莲花基原雪白睡莲与同科近源物种能够较好区分，雪白睡莲聚为一支，且分支支持率达 96%，ITS2 序列作为DNA条形码可准确鉴定睡莲花，将其与近源物种有效区分。睡莲花基原雪白睡莲及其近源物种鉴定结果见表2。

2.3含量测定

2.3.1对照品溶液制备分别取烟花苷、紫云英苷对照品适量，精密称定，各加甲醇制成每1 mL分别含烟花苷2.0 mg和紫云英苷 0.8 mg的溶液，再分别取0.5 mL置同一 25 mL 容

量瓶中，加适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）

稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含烟花苷 40 μg紫云英苷 16 μg的混合溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备取本品粉末（过3号筛）约 0.5 g，精密称定，密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min， ，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀， ，精密量取续滤液25 mL，置圆底烧瓶中，蒸去甲

，加入适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85），摇，转移至 25 mL容量瓶中，再加混合溶液（乙腈∶

0.2%磷酸＝15∶85）稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 色谱条件

采用 Agilent ZORBAX SB-Aq C18 柱（4.6 mm×

250 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为0.2%磷酸溶液（含1.0%四氢呋喃），梯度洗脱（0～65 min，15%→

11%A；65～75 min，11%→25%A；75～80 min，25%→

15%A；80～90 min，15%A），流速 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长 350 nm，进样量 10 μL。

2.3.4 系统适用性

取“2.3.1”项下对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样检测，重复测定6次，结果烟花苷、紫云英苷峰的理论塔板数平均值分别为 7140、6321，峰面积 RSD 分别为 0.44%、0.57%，符合系统适用性要求。

2.3.5 分离度

分别取“2.3.1”项下对照品溶液及“2.3.2”项下

供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样，供试品中烟花苷和紫云英苷峰与相邻峰的分离度均大于

1.5，对照品溶液和供试品溶液代表性图谱见图2。

2.3.6 检测限和定量限

取“2.3.1”项下对照品溶液，倍比稀释，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，当信噪比为 3∶1时得检测限，信噪比为10∶1得定量限。结果表明，烟花苷检测限为 1.0 —g/mL，定量限为 3.0 —g/mL；紫云英苷检测限为 1.0 —g/mL，定量限为 2.0 —g/mL。

2.3.7 线性关系考察分别取烟花苷和紫云英苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含烟花苷 2.0 mg和紫云英苷

0.8 mg的混合对照品溶液，作为对照品贮备液。分别取对照品贮备液 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL 置 25 mL

容量瓶中，各加适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝

15∶85）稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列对照品溶液。取各不同浓度的系列对照品溶液，按

“2.3.3”项下色谱条件进样检测。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。烟花苷回归方程为 Y＝31.09X－12.142（r＝0.999 9），线性范围为

4.004 ～ 80.073 μg/mL ；紫云英苷回归方程为 Y＝

13.304X－11.25（r＝0.999 5），线性范围为 1.612～

32.236 μg/mL。结果表明，烟花苷和紫云英苷进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.8 精密度试验

取本品，按“2.3.2”项下方法制备 6份供试品溶

液，取“2.3.1”项下对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算样品中烟花苷和紫云英苷的含量。结果显示，烟花苷平均含量为0.37%，

RSD＝1.56%；紫云英苷平均含量为 0.18%，RSD＝

1.41%。表明精密度良好。

2.3.9 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液，分别于 0、2、4、8、

12、24 h 按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果烟花苷和紫云英苷峰面积 RSD 分别为 1.03%、

1.68%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。

2.3.10 加样回收率试验取同一批已知含量的睡莲花样品粉末，精密称定，每份约 0.50 g，置具塞锥形瓶中，分别按已知含量的 80%、100%、120%加入烟花苷和紫云英苷对照

品，按“2.3.2”项下方法制备，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算样品中烟花苷和紫云英苷含量及加样回收率，结果见表 3。表明本方法的回收率良好。

2.3.11 样品测定

取 19 批睡莲花样品，按“2.3.2”项下方法制备

供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样检测，记

录色谱图，计算样品中烟花苷和紫云英苷的含量，结果见表4。

3 讨论维吾尔药来源复杂，在长期用药过程中，由于翻译错误、鉴定错误、代用混用等原因，药材质量标准整体偏低，药材监管难度大，诸多维吾尔药材的来源无法追溯，考证难度较大。本研究收集的睡莲花样品主要来源于维吾尔医药市场，鉴定结果表明，市售睡莲花以柔毛齿叶睡莲居多，而部颁标准中收载的雪白睡莲仅收集到1批。长期误用混用不仅影响了维吾尔药材标准的权威性，也造成了临床用药安全隐患。

DNA 条形码技术可追溯药材的基原，用于药材的快速、准确鉴定，在质量标准制定、药材流通和市场监理等实际应用中具有重要价值。

睡莲花药用历史久远，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药的主要组成药物，由于长期依赖于进口，导致基原不清、产地不明，传统的形态学鉴定对于区分不同种质资源存在一定的难度。本研究结果表明，DNA条形码技术具有通用性强、鉴定结果可靠、重复性良好等优点，可用于鉴定睡莲花基原植物雪白睡莲及其近源物种。

本研究建立了HPLC同时测定睡莲花中特征性成分烟花苷和紫云英苷的方法。试验考察了不同浓度甲醇对 2种成分的提取效果，结果发现甲醇提取的含量最高，因此选择甲醇作为提供溶剂。在耐用性试验中，

通过改变流动相流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱温

（28、30、32 ℃）评估检测条件的微小变动对测定结果的影响，结果表明，当流动相流速和柱温发生较小的变化时，对烟花苷和紫云英苷含量测定结果没有影响。

参考文献：

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国现代应用药学,2008,25(2)：115-117.

（收稿日期：2020-04-06）

（修回日期：2020-05-14；编辑：陈静）

图 1睡莲花及其近源物种NJ系统进化树表 2睡莲花样品DNA分子鉴定结果