峨眉山地区天南星科药用植物ITS2序列及二级结构分析

2020-12-15 -

郑颖，庞思奇，马嘉擎，任瑶瑶西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031

摘要：目的利用第二内部转录间隔区（ITS2）序列作为DNA条形码及其二级结构，对峨眉山地区天南星科药用植物进行鉴定及聚类分析。方法于四川峨眉山地区采集20个不同种天南星科药用植物样本，提取基因组DNA，对 ITS2 序列进行PCR扩增测序，从 GenBank 下载 26条天南星科植物 ITS2 序列；利用 MEGA7.0计算分析所有序列种内遗传距离及种间遗传距离，并采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树；根据 ITS2 数据库信息预测并比较所有不同种样本的 ITS2 序列二级结构差异。结果样本种间 K2P 最小遗传距

离（0.049）大于种内最大距离（0.021），有明显的条码间隔；NJ 树显示各属样本各聚为一大支，各属内各种样本又各聚为小枝；各属及各种样本ITS2二级结构均存在显著差异。结论将 ITS2 序列作为DNA条形码及其二级结构，可快速准确鉴定天南星科药用植物。

关键词：天南星科；DNA条形码；ITS2序列；二级结构；鉴定；资源调查

中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)12-0064-06

DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202004471 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

峨眉山地处四川盆地西南边缘，面积154 km2，最高峰海拔 3099 m，区域内相对高差近2600 m，气候垂直变化显著，使植物生长具备了优良的小环境，由山顶至山脚均分布着丰富多样的药用植物[1-2]。峨眉山境内有天南星科植物 37 种，大部分种类均在不同方面药用，有7种被《中华人民共和国药典》收载，

属于药用资源十分丰富的类群[3]。天南星属药用植物

具有燥湿化痰、消肿解毒、祛风止痉等作用[4-6]；菖

蒲属药用植物具有开窍化痰、镇静催眠等作用[7-9]；半夏属药用植物具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结

等作用，可治疗痰多咳喘、痰饮眩悸[4，10-11]；魔芋属药用植物具有抗肿瘤、解毒消肿、降血脂、降血糖等

作用[12-14]；海芋属药用植物具有清热解毒、消肿镇痛

作用，可治疗风湿骨痛、痈疽肿毒大疮等[15-16]。峨眉

山天南星科药用植物资源丰富，药用历史悠久，大部分兼具药用、食用、观赏价值，其中常见的有一把伞南星、半夏、石菖蒲、魔芋、虎掌、海芋等。

DNA 条形码技术是药用植物资源物种鉴定研究

的重要方法[17]。自陈士林[18]首次提出鉴定药用植物的标准 DNA 条形码为第二内部转录间隔区（ITS2）序列以来，核糖体DNA ITS2序列受到广泛关注，同时被多次用于多种药材和药用植物的鉴定，并表现出较

强的鉴定能力[19]。本课题组已建立丰富的药用植物DNA 条形码数据库，包括冬虫夏草、川贝母及多种藏药材等，均验证了 DNA 条形码技术的可行性。峨眉山地区的独特地形、气候适合天南星科植物的生长，拥有丰富的天南星科药用植物资源，为进一步扩增 DNA 条形码数据库，本课题组进一步探索峨眉山地区天南星科药用植物 DNA 条形码，验证 DNA 条形码技术在天南星科药用植物资源物种鉴定研究中的可行性。

本研究在峨眉山多个地区采集天南星科植物样本，进行 DNA 提取、PCR扩增及测序后，于 GenBank下载同属和同科植物 ITS2 序列，并以 ITS2 序列为DNA条形码，对所有 ITS2序列进行种间和种内遗传距离分析、构建系统进化树、二级结构预测及分析比较，鉴定天南星科药用植物。以期为天南星科药用植物研究奠定基础，同时为天南星科植物药材市场的可持续发展提供鉴别依据，并有助于进一步分析调查峨眉山药用植物资源的种群量、分布环境、种群动态等信息。

1 仪器与试药

T100 PCR扩增仪（美国 Bio-Rad）；植物基因组

DNA 提取试剂盒（北京天根生化有限公司，批号

DP305-02）；引物[成都擎科梓熙生物技术有限公司

（TSINGKE）合成]，100 μmol/L，正向 ITS2F，反向

ITS2R；移液器。

20 份天南星科植物样本于四川省峨眉山市龙池镇、张坝村、黄湾乡等地收集，经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授根据其形态特征进行鉴定，共 11 种植物（见表1），标本保存于西南交通大学标本室。同时通过 GenBank 数据库下载天南星科植物 ITS2 序列 26 条（见表2），使用 BLAST 方法在GenBank数据参考库中对这些序列进行核对，相似度均大于99%，且已有研究者发表过包含这些序列的相关文章，可保证其准确性。

2 方法

2.1样品 DNA 提取、PCR扩增及测序

参照陈士林[20]对植物样品 DNA提取、测序等方法，对所采集的天南星科植物样本进行 DNA 提取、

ITS2 片段 PCR 扩增及二代双向测序，测序公司为成都擎科梓熙生物技术有限公司。

2.2 数据处理

使用 CodonCode Aligner 软件获得每个序列的峰图，分析测序结果，去除两端序列，并使用 BLAST方法在 GenBank 数据参考库中对这些 ITS2 序列进行核对；测序得到的序列使用基于隐马尔可夫模型的HMM注释方法，去除拼接得到的一致序列的两端28S和 5.8S 区段，得到标准 ITS2 序列[21]，并使用 BLAST方法在参考库中对这些 ITS2 序列进行测试。结合从NCBI 下载的 ITS2 序列，使用 MEGA7.0 软件计算遗传距离，并在 K2P模型的基础上分析种内遗传距离和种间遗传距离，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）

[22]

构建系统进化树，各分支的支持率利用靴带法

（bootstrap，1000 次重复）进行检验。各种属植物样本 ITS2 序列的二级结构参照 Koetschan 等[23]建立的

ITS2数据库网站进行预测并比较。

3 结果

3.1 种内、种间K2P遗传距离分析一把伞南星、半夏、芋的ITS2序列长度均为251 bp，其他样本的 ITS2序列长度均不同。所有样本ITS2 序列长度为 231～285 bp，GC 含量为 62.3%～77.9%，平均GC含量为 71.1%（见表 1）。

研究发现，种间距离越大、种内距离越小的物种

间更适于条形码鉴定[24]。本研究在 K2P 距离模型的基础上，使用 MEGA7.0 软件计算样本种间及种内遗传距离，结果显示所有天南星科植物样本种内最大遗传距离为 0.021 ，种内遗传距离平均值为 0.000 ～

0.014，种间最小遗传距离为 0.049，见表 3。其中，一把伞南星 Arisaema erubescens 和花南星 Arisaema lobatum 遗传距离最近，虎掌 Pinellia pedatisecta 和石菖蒲 Acorus tatarinowii 遗传距离最远。各物种种间遗传距离均明显大于种内遗传距离，可见 ITS2 序列具有较好的种间特征，可作为鉴别天南星科植物的DNA条形码。

天南星科植物样本遗传距离热图见图 1。可以看出，样品种内、属内K2P遗传距离较小，为图中颜色最浅的区域；各属之间遗传距离较大，为图中颜色较深区域；热图中颜色最深的区域为菖蒲属 Acorus 与其他属样本种间遗传距离，其值最大。统计分析各样本种间和种内遗传距离变异分布（见图 2）发现，种间变异距离主要集中在 0.100～1.000，种内变异距离集中在 0.000～0.025，各样本间存在较明显的条码间隔，因此 ITS2 序列在种水平上对天南星科样本鉴定能力较强。

注：A1、A2、A3、A4、P1、P2、A5、A6、A7、A8、C1、T1、T2 依次为 Arisaema erubescens、A. lobatum、A. heterophyllum、A. flavum、Pinellia ternata、P. pedatisecta、Acorus tatarinowii、A. calamus、Amorphophallus konjac、Alocasia odora、Colocasia esculenta、Typhonium divaricatum、T. flagelliforme

图1天南星科植物样本遗传距离热图

3.2聚类树分析

所有 ITS2 序列样本NJ系统进化树见图3。通过系统发育关系分析天南星科各属之间亲缘关系的远近：天南星属、半夏属、芋属、海芋属、魔芋属聚为一大支，表明其亲缘关系较近；菖蒲属、犁头尖属分别聚成一个进化支，与其他物种有效区分，表明它们与其他属之间的亲缘关系较远；靴带法 1000 次检验各分支支持率均在 62%以上，同时各属内各物种的

ITS2 序列均独立聚为一小支，各支支持率均在 50%以上，展现出较好的单系性，系统进化树体现了不同属之间的进化关系。NJ 系统进化树表明，ITS2 序列可以识别不同种类的天南星科植物并将它们有效分开，鉴定成功率为100%。

3.3 ITS2 序列二级结构分析

根据 Koetschan 等[25]建立的 ITS2 数据库及网站预测天南星科植物的 ITS2 二级结构，所有样本 ITS2序列的二级结构见图 4。结果表明，所有物种的二结构均由一个中心环及4 个螺旋区（Helix）组成，各物种在4个螺旋区的茎环（Loop）数量、长度、状、位置、大小方面均存在明显差异。如 A.calamus、

odora、A.erubescens、A.tatarinowii 的中心环均为圆形但大小不同，且4个螺旋区的茎环数目均不相同，可明显区分开，其他物种的中心环均为异形，但中心环的形状及螺旋区均有所不同。因此，通过 ITS2 二级结构可以较直观地鉴别天南星科植物。

4 讨论

DNA 条形码鉴定技术不受环境、样品、试剂、部位、形态等的限制，弥补了传统鉴别方法的不足，成为鉴别中药基原植物和药材品种的有效手段，为药材基原物种的鉴定提供了有力的科技支撑，应用日益

广泛[26]。研究表明，ITS2 序列区域具有较高的变异

性、相对稳定的遗传距离和较高的识别效率[27]，同时，其对植物具有良好的物种水平鉴定成功率和扩增成

功率[28]。

已有的天南星科植物 ITS2 序列研究主要包括：利用 rbeL、matK 序列结合 ITS2 和 psbA-trnH 序列考察天南星科植物的 PCR 扩增效率以及种、属水平的

鉴定成功率[29]；利用 ITS2 序列对天南星科菖蒲属植物进行生药学鉴定并筛选其最佳适应 DNA 条形码序列，建立分子鉴定石菖蒲的 PCR 方法，探讨菖蒲属

基原问题[30]等。本研究主要利用 ITS2 序列作为DNA条形码及其二级结构对峨眉山地区 20 种天南星科药用植物进行鉴定及聚类分析，为天南星科 DNA 条形码数据库的建立奠定基础。本研究以传统调查方法为基础，将现代实验方法、计算机技术与中药材资源鉴定相结合，在准确鉴定天南星科药用植物的同时，能够为峨眉山地区该属药用植物的分布、种群及种群量研究提供指导，有利于掌握其分布特点、生态环境，在正确评价天南星科药用资源状况的基础上，构建中药资源长效保护机制，对其质量控制、安全用药及资源保护和合理开发利用提供科学依据。

本研究将采自峨眉山不同地区的 20 份天南星科植物样本 PCR 扩增、测序，采用隐马尔可夫模型的注释方法获得 ITS2 序列，并从 GenBank 上下载同科序列 26 条。用 MEGA7.0 软件分析种内、种间遗传距离并构建 NJ 系统进化树，对其样本间的条码间隔进行考察。天南星科植物样本种间和种内遗传距离分析显示，种内和种间变异分布有明显的条码间隔，其在热图上颜色较深，属内颜色次之，种内颜色较浅。NJ系统进化树表明，天南星科不同属之间聚为几个不同大支，亲缘关系较远，同属之间亲缘关系较近，属内不同种之间各聚为一小支。结合所有样本 ITS2 序列种间及种内遗传距离值、条码间隔分析、系统进化树构建以及二级结构预测、比较等多种方法对 ITS2 序列的天南星科植物鉴定能力从不同方面进行了考察，结果表明，以 ITS2 序列作为DNA条形码，在种水平上能够很好地鉴定天南星科药用植物样本。因此，将

ITS2序列作为DNA条形码对天南星科植物进行鉴定具有准确、便捷的优势。

峨眉山素有“仙山药园”的美誉，药用、观赏、

食用等方面的资源植物丰富多样[31]。利用 DNA 条形码技术，可弥补传统形态学鉴定方法的不足，能够快速、准确地鉴定某些药用植物，有助于对峨眉山地区的药用植物资源进行大范围分析、调查。在不影响植物种类发展的前提下，进行合理的开发利用，更有利

于药用植物资源保护[32]。药用植物种类多、分析数据量大，为使保护决策更科学，必须充分利用有关数据

并建立有效的计算机信息管理系统[33]，结合植物种群分布特征与生态环境，正确全面评价药用植物资源当前状况，在此基础上制定切实可行的保护及合理开发利用方案。

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