白茅根标准汤剂超高效液相色谱指纹图谱研究

童培珍，李振雨，曹斯琼，何嘉莹，孙冬梅，陈向东，李国卫广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

摘要：目的 建立白茅根标准汤剂超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱。方法 采用 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.1%磷酸水为流动相，梯度洗脱，流速 0.32 mL/min，检测波长 325 nm，柱温 40 ℃，建立 15批白茅根标准汤剂指纹图谱。采用相似度评价、聚类分析和主成分分析对 15批白茅根标准汤剂指纹图谱进行研究，并测定样品中绿原酸的含量。结果 建立了白茅根标准汤剂的UPLC指纹图谱，标定了13 个共有峰，15批样品相似度为0.821～0.998，通过聚类分析将样品大致分为三类。绿原酸在 1.853 9～185.393 1 μg范围内线性关系良好，平均加样回收率为101.77%。结论 本研究建立的白茅根标准汤剂指纹图谱方法准确可靠、重复性好，可为白茅根标准汤剂及其相关制剂的质量评价提供参考。关键词：白茅根；标准汤剂；指纹图谱；绿原酸；相似度；聚类分析；主成分分析

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)12-0070-06

DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202001225 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

白茅根为禾本科植物白茅 Imperata cylindrica Beauv. var. major（Nees）C. E. Hubb.的干燥根茎，具有凉血止血、清热利尿功效，用于血热吐血、尿血、衄血、热病烦渴、黄疸、水肿、热淋涩痛、急性肾炎水肿等[1]。白茅根化学成分研究始于 20 世纪 60 年代，

日本学者首次从白茅根中分离得到三萜类成分[2]。随着天然药物分离检测技术的发展，又相继分离得到苯丙素类、木脂素类、糖类、内酯类、甾醇类和有机酸

类化合物[3-7]。中药饮片标准汤剂可衡量中药配方颗粒质量，从

而提高临床用药的准确性和疗效的一致性[8]。中药配方颗粒是在中医药理论指导下将单味中药饮片经现代技术提取、浓缩、干燥制粒而成，其作为一种新型

的中药饮片改进剂型，既体现了中医辨证论治随证加减的特性，又具有安全、可控、起效快、易吸收、使

用方便等优点[9]。2015 年 12 月，原国家食品药品监督管理总局公布了《中药配方颗粒管理办法（征求意见稿）》，国家药典委员会随后发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，提出标准汤剂的概念，规定中药配方颗粒的所有药学研究

均应与标准汤剂进行比对，保证两者质量一致性[10]。本试验对白茅根中绿原酸进行含量测定，并开展超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱研究，旨在为白茅根标准汤剂及其相关制剂的质量控制研究提供参考。1 仪器与试药

陶瓷保健壶（深圳一枚王有限公司），RE-3000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-DⅢ循环

水真空泵（巩义市予华仪器有限公司），DLSB-5120低温冷却液循环水泵（郑州长城科工贸有限公司），

TRL-0.5真空冷冻干燥机（大连双瑞科技有限公司）， Waters H-Class 超高效液相色谱仪（沃特世公司， Empower 3 网络版），ME204E 万分之一天平、XP26百万分之一天平（梅特勒-托利多公司）。

绿原酸对照品（批号 110753-201716，含量 99.3%，中国食品药品检定研究院），甲醇、乙醇（分析纯，广东光华科技有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，默克公司），磷酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），超纯水（实验室自制）。白茅根药材 15 批，购自河北、安徽、江苏等地（见表1），经广东一方制药有限公司质量中心检验，均为禾本科植物白茅Imperata cylindrica Beauv. var. major（Nees）C. E. Hubb.的干燥根茎。按 2015 年版《中华人民共和国药典》白茅根项下规定炮制成白茅根饮片。2 方法与结果

2.1标准汤剂制备

取白茅根饮片 100 g，置陶瓷保健壶中，第1 次煎煮加9倍量水，浸泡30 min 后武火（500 W）煮沸，

文火（250 W）保持微沸，煎煮20 min，煎液用 350

目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加 7 倍量水，武火（500 W）煮沸，文火（250 W）保持微沸，煎煮25 min，煎液用 350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩（温度65 ℃，转速 80～90 r/min，

真空度-0.08～-0.1 MPa）至 200 mL，真空冷冻干燥，即得白茅根标准汤剂。

2.2 指纹图谱建立与分析

2.2.1 色谱条件

采用 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱

（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相 A为甲醇、B为 0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～4 min，4%A；4～

12 min，4%～7%A；12～15 min，7%～10%A；15～

30 min，10%～18%A；30～30.1 min，18%～90%A；

30.1～37 min，90%A），流速 0.32 mL/min，检测波长

325 nm，柱温 40 ℃，进样量2 μL。

2.2.2 对照品溶液制备取绿原酸对照品适量，加 10%甲醇制成每 1 mL含 10 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备

取白茅根标准汤剂（S5）约 0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇 15 mL，称定质量，超声处理（功率 300 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用10%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

精密称取白茅根标准汤剂（S5）约 0.1 g，按“2.2.3”

项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，连续进样 6 次，结果各色谱峰相对保留时间

RSD＜2.0%，相对峰面积 RSD＜2.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重复性试验取同一批白茅根标准汤剂约0.1 g，精密称定，平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果各色谱峰相对保留时间

RSD＜1.0%，相对峰面积 RSD＜5.0%，表明本方法重复性良好。

2.2.4.3 稳定性试验

取白茅根标准汤剂（S5）约 0.1 g，精密称定，按

“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，结果各色谱峰相对保留时间RSD＜2.0%，相对峰面积RSD＜2.0%，表明供试品溶液在 12 h内稳定。

2.2.5共有峰确定

制备 15 批白茅根标准汤剂的供试品溶液，按

“2.2.1”项下色谱条件进样测定，得到指纹图谱，并对色谱图进行匹配，使用国家药典委员会《中药色谱

指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对 15 批白茅根标准汤剂指纹图谱进行共有峰标识，并生成对照图谱，见图1、图 2。

以 8号峰为参照峰，各批样品的共有峰的相对保留时间与相对峰面积见表2、表3。各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步定为白茅根的指标成

分。经对照品对照，8号峰为绿原酸，选定为参照峰。

S10～S12（江苏）白茅根标准汤剂峰 3 及峰 12 的相对峰面积偏高，表明各标准汤剂成分组成相似，但含量差异较大。

2.2.6相似度评价

以白茅根标准汤剂共有模式为对照图谱，15批白茅根标准汤剂与对照指纹图谱的相似度为 0.821～

0.998，除 S10～S12（江苏）外，其余各批次样品与对照指纹图谱的相似度均大于 0.9，表明其他各产地药材具有良好的相似度，见表4。

2.2.7聚类分析

将 15 批白茅根标准汤剂色谱峰峰面积导入

SPSS20.0 软件，采用组间联接法，选用欧氏距离对白茅根标准汤剂样品进行聚类分析，结果见图3。

聚类分析可将 15 批白茅根标准汤剂主要分成三大类，类Ⅰ包括 S10、S11、S12，即江苏省样品为一类；类Ⅱ包括 S1、S2、S3、S7、S8、S9，即安徽省样品为一类；类Ⅲ包括 S4、S5、S6、S13、S14、S15，即河北省样品为一类。总体看来，相同产地白茅根标准汤剂质量相近，与相似度分析结果一致。

2.2.8 主成分分析

采用SPSS20.0软件对15批白茅根标准汤剂的13个变量（共有峰峰面积）进行标准化处理，以主成分的方差贡献率及特征值为依据，进行主成分分析，计算相关系数矩阵、主成分特征值、方差贡献率及主成分综合得分，结果见表 5，碎石图见图 4。前 2 个成分的特征值均大于 1，分别为 9.476、1.441，对总方差的累积贡献率达 83.973%，故选择成分 1、2 作为第一、第二主成分，可代表白茅根标准汤剂指纹图谱共有峰的大部分信息。结合碎石图可以看出主成分分析中特征值的变化情况，图中曲线存在一个明显的拐点，表明前2个主成分的分析结果可基本显示出不同批次白茅根标准汤剂之间的相似度和差异性。初始因子载荷矩阵见表 6。可以看出，第一主成分主要反映来自原始指标色谱峰 1、2、3、6、8、10、11、13 的信息，第二主成分主要反映了来自原始指标色谱峰12的信息，故仅用前2个主成分就可表示UPLC 指纹图谱数据的主要信息。以第一、第二主成分为变量，得到二维投影图（见图 5）。以 X 轴为例，在投影图中选取距原点较远的几个点，得到第一主成分中变量的权重，权重越大则该化合物在白茅根标准汤剂中的作用越大。其中，前 3 位变量的权重均为 0.971，对应峰2、峰 5 和峰8（绿原酸）。

根据前2个主成分对白茅根标准汤剂进行评价，计算综合得分，结果见表 7。河北省样品白茅根标准汤剂综合得分排名最高，安徽省次之，江苏省最低。

2.3含量测定

2015年版《中华人民共和国药典》白茅根项下仅收载了性状和鉴别项，尚无含量测定项。主成分分析结果显示，在第一主成分中，峰 8（绿原酸）的权重为 0.971，在区分各产地白茅根标准汤剂指纹图谱中起决定性作用。故本试验以绿原酸为含量测定指标，对 15批白茅根标准汤剂进行测定。

2.3.1 色谱条件及溶液制备

同“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下。

2.3.2 方法学考察

2.3.2.1 线性关系考察精密称定绿原酸对照品 3.734 mg，置 20 mL量瓶中，用10%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为绿原酸贮备液，精密量取上述贮备液 0.2、0.4、1、2、4 mL，分别置 20 mL 量瓶中，加 10%甲醇稀释并定容至刻

度，摇匀。按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，线性回归方程为 Y＝19 262 737X－3474，R2＝1.000，结果表明在 1.853 9～185.393 1 μg范围内呈良好线性关系。

2.3.2.2 精密度试验

精密吸取白茅根标准汤剂（S5）供试品溶液，按

“2.3.1”项下色谱条件重复进样 6次，结果绿原酸峰面积RSD＝0.12%，表明仪器精密度良好。

2.3.2.3 重复性试验

取白茅根标准汤剂（S5）约 0.1 g，精密称定，平行称定6 份，制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果绿原酸含量 RSD＝0.94%，表明本方法重复性良好。

2.3.2.4 稳定性试验

取白茅根标准汤剂（S5）供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别在 0、2、4、6、8、10、12 h 进样测定，结果绿原酸峰面积 RSD＝0.38%，表明供试品溶液在 12 h内稳定。

2.3.2.5 加样回收率试验

取已知含量的白茅根标准汤剂（S5）约0.05 g，精密称定，平行3组，每组3份，分别按 1∶0.5、1∶

1、1∶1.5 比例加入相应绿原酸对照品并制备供试品

溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，结果平均回收率为 101.77%，见表 8，表明本方法可用于绿原酸含量的准确测定。2.3.3样品测定

精密吸取绿原酸对照品溶液和白茅根标准汤剂供试品溶液各2 μL，按“2.3.1”项下色谱条件测定，外标两点法计算绿原酸含量，结果见表9。S10～S12样品绿原酸含量偏低，与相似度、聚类分析结果一致。3 讨论本试验运用相似度分析、聚类分析和共有峰主成分分析3种方法对不同产地的白茅根标准汤剂UPLC

指纹图谱进行分析。15批白茅根标准汤剂中12 批图谱的相似度在 0.9 以上，表明不同产地的白茅根标准

汤剂质量比较一致。从聚类分析结果可以看出，3 批江苏省样品聚为一类，含量测定结果表明，这3 批样品的绿原酸含量较其他批次低，导致相似度偏低，反映出这 3批样品质量较差；另外，6批安徽省样品聚

为一类，6 批河北省样品聚为一类。从主成分分析结

果可知，15批白茅根标准汤剂中13个特征变量降维至 2个主成分，且这2个主成分可代表白茅根标准汤剂指纹图谱的大部分信息，由 15 份白茅根标准汤剂样品主成分得分图可知，河北省及安徽省样品质量较好且稳定。主成分分析结果与聚类分析及相似度分析结果一致。

2015年版《中华人民共和国药典》白茅根项下无含量测定项，对白茅根的质量评价存在不足。本研究建立的指纹图谱及含量测定方法，可较好地评价不同产地白茅根制备的标准汤剂质量，为白茅根药材及其制剂的质量评价提供参考。

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（收稿日期：2020-01-14）

（修回日期：2020-02-08；编辑：陈静）