CJI (Traditional Chinese Medicine)
基于网络药理学探讨活血益气方促进心肌梗死后血管新生作用机制
吴丹丹，国倩倩，高毅洁，王曼曼，贾冬冬，杨睿，张冬梅，朱珂
北京中医药大学东直门医院，北京 100700
摘要：目的 基于网络药理学探讨活血益气方促进心肌梗死后血管新生的活性成分，并预测其可能机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索活血益气方组方药物黄芪、党参、丹参、川芎、
赤芍、红花，筛选口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的药物有效成分及相应靶点；检索 OMIM、GeneCards数据库，得到心肌梗死后血管新生相关靶点；将活血益气方靶点与心肌梗死后血管新生靶点的交集输入String数据库，获得靶点蛋白相互作用关系，根据蛋白相互作用密切度得到核心靶点，使用Cytoscape3.7.0 软件可视化核心靶点-药物成分相互作用网络，对该网络进行拓扑学分析，得到活血益气方促进心肌梗死后血管新生的核心成分；使用 DAVID 数据库对靶点进行GO分析和 KEGG通路富集分析。结果 筛选得到活血益气方有效活性化合物 148 个，相应靶点275个，疾病相关靶点418个，药物与疾病的交集靶点78个；蛋白相互作用网络显示，与其他靶点关系密切的靶点为 STAT3、JUN、AKT1；GO 生物功能分析和 KEGG 通路富集分析得到
447条生物功能条目及101条信号通路。结论 活血益气方可能通过多成分、多靶点、多通路实现促进心肌梗死后血管新生的作用。
关键词：活血益气方；网络药理学；心肌梗死；血管新生
中图分类号：R259.422.2；R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2020)12-0076-07
DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.201911494 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
在缺血性心脏病中，血管新生是缺血区侧支循环
的建立，能够实现心肌缺血区的“自我搭桥”[1]，完成血管床的再建，对患者的治疗及预后意义重大。缺血性心脏病患者在缺血缺氧环境刺激下，会自发生成
新的血管以改善其缺血缺氧状况[2]，但病理条件下的血管新生很微弱，不足以改善症状。外源性干预促进缺血区血管新生能够改善缺血区的病理状况，增加缺血区的新生血管，在一定程度上改善缺血区的血供，
从而缓解症状[3]。近年来，生长因子、基因和细胞移植等外源性干预促血管新生治疗缺血性疾病的基础研究取得了一定进展，但临床研究结果并不理想。因此，在缺血性心脏病中，寻找更为有效和安全的药物是促血管生成的关键问题。
活血益气方依据活血益气法组方，由黄芪、党参、丹参、川芎、赤芍、红花6味中药组成，临床应用显示其可防治心肌梗死后心力衰竭，动物实验研究显示
该方可逆转心肌梗死后心室重构[4-5]。本课题组前期研究表明，活血益气方可促进急性心肌梗死模型大鼠
心肌梗死边缘区血管新生[6-12]。前期研究显示，活血益气方具有促进心肌梗死后血管新生的药理作用，然而其作用机制尚不清楚。中药复方具有多成分、多靶点的特点。中药网络药理学集合了数据库检索、靶点功能分析、靶点通路富集分析等多种研究手段，从整体角度展现中药成分靶点间的相互作用关系，在不拆分中药各成分的前提下对中药可能的作用机制进行
分析[13-14]。本研究利用网络药理学方法对活血益气方促进心肌梗死后血管新生的作用机制和靶点进行预测和分析，为该方的深入研究提供依据。1 资料与方法1.1 药物成分及靶点获取使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP， http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）依次检索黄芪、党参、丹参、川芎、赤芍、红花，设定参数口服生物利用度
（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，获得相应药物的化合物成分。在数据库中输入化合物成分，获得其对应的靶点。
1.2 疾病靶点收集
进入OMIM数据库（http://omim.org/），点击“Gene Map”，以“myocardial infarction angiogenesis”为检索词进行检索，将检索结果下载为 excel 文件。进入GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），以“myocardial infarction angiogenesis”为检索词进行检索，将检索结果下载为 excel 文件。将上述检索结果进行合并，获得心肌梗死后血管新生疾病靶点。
1.3 药物与疾病靶点映射将活血益气方有效活性成分作用靶点与心肌梗死后血管新生疾病靶点取交集，得到活血益气方促进心肌梗死后血管新生的靶点蛋白。进入 UniProtKB 数据库（https://www.uniprot.org/uniprot/），输入靶点蛋白，Organism 选择“Homo sapiens”，获得蛋白靶点基因名称。
1.4 靶点蛋白相互作用网络分析
进入 String 数据库（https://string-db.org/），选择“Multiple proteins”，输入靶点蛋白，物种选择“Homo sapiens ”，在设定中将互动得分设置为最高置信度
0.9，隐藏网络中断开的节点，获得活血益气方促进心肌梗死后血管新生蛋白靶点的相互作用图及作用结果。对蛋白相互作用结果进行分析，根据密切程度找出核心靶点。使用 Cytoscape3.7.0 软件可视化活血益气方促进心肌梗死后血管新生的核心靶点及其对应的药物成分网络，使用 NetworkAnalyzer 插件对该网络进行拓扑学分析，得到核心靶点及其对应成分的拓扑学数据。
1. 5 GO分析和 KEGG通路富集分析
使用 DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对活血益气方促进心肌梗死后血管新生的靶点蛋白进行分析，选择“Functional Annotation”，将靶点蛋白基因名称输入 Uplode 中 Enter Gene List，Select Identifier 选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 设为“Gene List”，List 中 Select species 选择“Homo sapiens”，Background 中 Select a background 设置为“Homo sapiens”，在 Gene_Ontology 分析中选择“GOTERM_BP_DIRECT ”“GOTERM_CC_DIRECT ” “GOTERM_MF_DIRECT”进行分析，在 Pathways分析中选择“KEGG_PATHWAY”进行分析。
2 结果
2.1 药物有效成分及靶点
通过 TCMSP获得各药物有效成分，包括黄芪20
个、党参 21 个、丹参 65 个、川芎7个、赤芍 29 个、红花 22 个，合并共有成分，得到 148 个有效活性化合物。通过 TCMSP获得有效成分的靶点蛋白，合并共有靶点，得到275个药物成分靶点。
2.2 药物治疗疾病靶点
分别通过 GeneCards、OMIM 数据库得到心肌梗死后血管新生相关靶点 415、3 个，合并靶点并将其与活血益气方成分靶点蛋白取交集，获得78个作用靶点。
2.3 蛋白相互作用网络分析活血益气方促进心肌梗死后血管新生靶点蛋白相互作用网络见图1，相互作用关系紧密的前10 个蛋白靶点见图 2。STAT3、JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、MAPK8、MAPK13、VEGFA、IL6 等靶点蛋白在网络中与其他蛋白相互作用关系紧密。
采用 Cytoscape3.7.0 软件对核心靶点及其对应的药物成分网络关系可视化构建结果见图 3，对该网络的拓扑学分析结果见表 1。节点的自由度表示网络中与该节点直接作用的节点数目，自由度越大则生物学重要性越强。活血益气方促进心肌梗死后血管新生的核心靶点对应的核心成分主要有 luteolin（槲皮素）、quercetin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、baicalein （黄芩素）等。
2.4药物作用靶点GO分析
活血益气方作用靶点GO分析共获得 P＜0.05 的条目 447 条，包括分子功能 61 条、生物过程 348 条和细胞组成 38 条，前 10 位结果见图4。活血益气方促进心肌梗死后血管新生的作用靶点在分子功能中富集于酶结合、转录因子结合、同一蛋白结合、蛋白质结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性及配体激活序列特异性 DNA 结合、细胞因子活性、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白质均聚活性、类固醇激素受体活性、蛋白酶结合等条目；在生物过程中富集于基因表达的正调控、低氧反应、脂多糖介导的信号通路、一氧化氮合成过程的正向调节、缺氧的细胞反应、凋亡过程的负调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、正调
控血管新生、转录的正向调节及 DNA 模板、炎症反应等条目；在细胞组成中富集于细胞外空间、细胞外区、膜筏、胞质溶胶、小窝、细胞外基质、细胞表面、膜、质膜外侧面、线粒体等条目。
5药物作用靶点KEGG通路富集分析
KEGG 通路富集分析共获得 P＜0.05 的通路 101条。活血益气方促进心肌梗死后血管新生蛋白靶点富集于 TNF 信号通路、癌症通路、乙肝、恰加斯病、
形虫病、大肠癌、蛋白聚糖在癌症中、结核、HIF-1信号通路、非酒精性脂肪性肝病等通路，前 10 位见表 2，气泡图见图 5。图中点的大小表示通路富集的基因数目，点越大表示富集的基因数目越多；点的颜色表示P值，点越红表示富集的显著性越高。
讨论中医学认为，心肌梗死的基本病机为气虚血瘀，此设立的活血益气法已被广泛用于心肌梗死的治，活血益气方即依据活血益气法组方而成。由于心梗死后血管新生是诸多因子参与的一系列相互衔、相互影响的过程，其调控网络十分复杂。通过网药理学方法对活血益气方促进心肌梗死后血管新靶点、成分、生物功能及通路进行分析，能够更好地阐释其作用机制。
通过对活血益气方促进心肌梗死后血管新生蛋
白靶点相互作用关系分析可知，STAT3、JUN、AKT1蛋白与其他靶点蛋白的相互关联程度最高，提示其可
能参与的药理作用最明显。STAT3是 STAT 蛋白家族的一员，能被多种细胞因子和生长因子通过磷酸化反应激活，介导多种基因的表达，在血管新生中起关键
作用[15-16]。JUN 蛋白指 c-jun、junB 及 junD，是转录因子 AP-1 家族的成员。AP-1最主要的一个结构形式是由 c-jun 和 c-fos形成的异源二聚体，在环境损伤、氧化剂等环境因素的刺激下可激活c-jun 和 c-fos，进而形成高活性的 AP-1，AP-1 与 DNA 结合后调控多种基因的表达，它通过调节血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶和细胞炎症因子等促凋亡
因子的表达，与血管生成密切相关[17]。AKT1 是3种
密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，能够调节代谢、增殖、细胞存活、
生长和血管生成等多种生理过程[18-20]。槲皮素、木犀草素等多个活血益气方核心靶点所对应的药物成分具有心血管保护作用。槲皮素是黄酮类化合物，广泛存在于水果和蔬菜中，可降低心血管疾病风险。槲皮素及其代谢产物通过磷酸化 AMP 依赖的蛋白激酶（AMPK）诱导内皮型一氧化氮合酶活
性改善血管功能[21]。研究发现，切除小鼠右侧股动脉诱导后肢缺血，给予槲皮素苷可显著促进缺血后肢血
流量恢复，增加缺血肌肉毛细血管密度[22]。木犀草素具有抗炎、抗氧化等多种生物学和药理学活性，在饮食中添加木犀草素可预防心血管疾病。木犀草素可减轻高碳水化合物/高脂肪饮食诱导的大鼠心肌炎
症[23]。山柰酚属于黄酮类化合物，具有抗氧化活性和
抗炎作用[24]，具有心血管保护作用[25-26]。黄芩苷具有预防和治疗心血管疾病的潜力，能够通过激活雌激素相关受体α途径诱导 VEGF 表达而参与血管生成[27]。
对活血益气方调控心肌梗死后血管新生的靶点蛋白GO功能富集分析发现，其功能富集覆盖了心肌梗死后血管新生的许多过程，包括血管新生、细胞对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、平滑肌细胞增殖的阳性调节、细胞迁移参与发芽血管生成的正调控、血管内皮细胞迁移的阳性调节、血管内皮生长因子产生的正调控、细胞对血管内皮生长因子刺激的反应，表明其通过多途径、多靶点发挥治疗作用。
KEGG通路富集分析结果显示，TNF信号通路及
HIF-1 信号通路可能是活血益气方促进血管新生的关键通路。肿瘤坏死因子（TNF）作为一种重要的细胞因子，可诱导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡和细胞存活以及炎症和免疫力。TNF信号传导诱导许多
基因的激活，在血管新生中发挥着重要作用[28-29]。在
心肌梗死后血管新生过程中，HIF-1 信号通路在心肌梗死后心肌缺氧状态下调控多种促血管新生因子如VEGF、血管生成素的协调表达，介导缺氧状态下的
血管新生[30-31]。本研究采用网络药理学方法对活血益气方促进心肌梗死后血管新生的靶点及通路进行分析，系统阐释了活血益气方可能的作用机制，可为该方机制的进一步深入研究提供依据。
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（收稿日期：2019-11-26）
（修回日期：2019-12-15；编辑：陈静）