左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层IR/IRS-1 信号通路和能量代谢的影响

1，2， 3， 1， 1， 1，2， 2， 1， 1， 2杨蕙 朱青 李薇 雷诗卉 刘检 孟盼 刘林 肖望重 王宇红

1.湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；3.湖南省肿瘤医院，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南 长沙 410013

摘要：目的 观察左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层胰岛素信号通路相关蛋白表达及能量代谢的影响。方法 建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。将大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（二甲双胍＋氟西汀）组和左归降糖解郁方高、中、低剂量组，各组灌胃给予相应药物4周后，尾尖采血测量大鼠空腹血糖，旷场实验和强迫游泳实验评价大鼠抑郁样行为， ELISA 检测大鼠血清胆固醇（ TC）、三酰甘油（ TG）及前额叶皮层葡萄糖和丙酮酸含量， Western blot检测大鼠前额叶皮层胰岛素受体（ IR）、胰岛素受体底物-1（IRS-1）、

p-IR、p-IRS-1 蛋白表达及葡萄糖转运体 4（GLUT4）蛋白的膜表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖、血清TC 和 TG含量显著增加（ P＜ 0.01， P＜ 0.05），旷场实验活动次数显著减少，强迫游泳实验不动时间显著延长（ P＜ 0.01），大鼠前额叶皮层葡萄糖含量显著增加，丙酮酸含量显著减少， p-IR/IR 和 p-IRS-1/IRS-1

比值及 GLUT4蛋白膜表达均显著降低（ P＜ 0.01， P＜ 0.05）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠空腹血糖、血清TC 和 TG含量减少（ P＜ 0.01），旷场实验活动次数增加，强迫游泳实验不动时间缩短（ P＜ 0.01），大鼠前额叶皮层葡萄糖含量显著减少，丙酮酸含量显著增加， p-IR/IR 和 p-IRS-1/IRS-1 比值及 GLUT4 蛋白膜表达均显著升高（ P＜ 0.01）。结论 左归降糖解郁方可通过激活糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层 IR/IRS-1 信号通路，促进GLUT4膜转位并加速神经元能量代谢，从而发挥抗抑郁作用。

关键词：左归降糖解郁方；糖尿病并发抑郁症；前额叶皮层；胰岛素受体；能量代谢；大鼠中图分类号： R285.5 文献标识码： A 文章编号： 1005-5304(2022)02-0074-05

DOI： 10.19879/j.cnki.1005-5304.202106219 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction on IR/IRS-1 Signaling Pathway and Energy Metabolism in Prefrontal Cortex of Rats with Diabetes Complicated with Depression

YANG Hui1,2, ZHU Qing3, LI Wei1, LEI Shihui1, LIU Jian1,2, MENG Pan2, LIU Lin1, XIAO Wangzhong1, WANG Yuhong2

1. Medical Innovation Experimental Center, The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. Technology Innovation Center, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;

3. Hunan Cancer Hospital; The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China

Abstract: Objective To observe the effect of Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction on the energy metabolism and insulin signaling pathway related protein expression in the prefrontal cortex of rats with diabetes complicated with depression. Methods Rats model of diabetes complicated with depression was established. Rats were randomly divided into control group, model group, positive drug group (metformin combined with fluoxetine), Zuogui

Jiangtang Jieyu Decoction high-, medium, and low-dosage groups. After 4 weeks of administration of corresponding drug for gavage, blood was collected from the tail tip to measure the fasting blood glucose of the rats. The open field test and forced swimming test were used to evaluate the depression-like behavior of rats. ELISA was used to detect

the total contents of cholesterol (TC) and triglyceride (TG) in serum and the content of glucose and pyruvate in the prefrontal cortex. Western blot was used to detect the proteins expression of insulin receptor (IR), insulin receptor substrate (IRS-1), p-IR and p-IRS-1 in the prefrontal cortex and the membrane expression of glucose transporter 4 (GLUT4). Results Compared with the control group, the contents of fasting blood glucose, TC and TG in serum significantly increased in the model group ( P< 0.01, P< 0.05). The immobility time was significantly prolonged in forced swimming test and the number of activities was significantly reduced in the open field experiment ( P< 0.01). The content of glucose in the prefrontal cortex significantly increased, the content of pyruvate significantly decreased, and the ratio of p-IR/IR, p-IRS-1/IRS-1 and the membrane expression of GLUT4 significantly decreased ( P< 0.01,

P< 0.05). Compared with the model group, the contents of fasting blood glucose, TC and TG in serum significantly reduced in Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction high-dosage group. The immobility time was significantly shortened in the forced swimming test and the number of activities was significantly increased in the open field test ( P< 0.01). The content of glucose in the prefrontal cortex significantly decreased, the content of pyruvate significantly increased, the ratio of p-IR/IR, p-IRS-1/IRS-1 and the membrane expression of GLUT4 significantly increased ( P< 0.01).

Conclusion Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction can increase the membrane translocation of GLUT4 and promote the energy metabolism of neurons by activating the IR/IRS-1 signaling pathway in the prefrontal cortex of diabetic rats with depression, thereby exerting the antidepressant effect.

Keywords: Zuogui Jiangtang Jieyu Decoction; diabetes complicated with depression; prefrontal cortex; insulin receptor; energy metabolism; rats

2020 年发布的《中国居民营养与慢性病状况报告》显示，我国糖尿病患病率为11.9%，抑郁症患病率为 2.1%[ 1]。临床研究显示，糖尿病与抑郁症之间存在双向诱发风险[ 2]，但诱发因素和机制仍存在较多争议。胰岛素抵抗是糖尿病的典型病理特征，而针对肥胖型抑郁症患者的临床研究发现，胰岛素抵抗的严重程度与患者的抑郁状态呈正相关[3]。糖尿病不仅会导致外周胰岛素抵抗，也会导致中枢胰岛素抵抗。胰岛素在中枢具有多种神经调节功能，其可通过作用于胰岛素受体（ IR）参与调控能量代谢等过程和情绪、认知等神经行为[4]。其中，神经元的能量代谢是细胞所有活动的基础。研究认为，胰岛素抵抗可通过影响葡萄糖转运体（ GLUT）的膜表达，干扰神经元的能量代谢[5]。

左归降糖解郁方是在经典名方左归丸基础上化裁而成。前期研究发现，左归降糖解郁方可通过调节海马、下丘脑胰岛素信号改善糖尿病并发抑郁症大鼠外周胰岛素抵抗[7-8]。研究还认为，左归降糖解郁方对下丘脑胰岛素信号的调节与其调控外周糖代谢相关度较高[ 7]，而对海马胰岛素信号的调节则与改善动物抑郁样行为和认知功能有关[8]。前额叶皮层是 IR高表达的另一脑区，也是与抑郁症密切相关的脑区之一[9]。本实验研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠前额叶皮层 IR/IRS-1 信号通路和能量代谢的影响，从而进一步丰富左归降糖解郁方对多脑区调节的作用特点。1 实验材料1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠 48只，体质量 190～210 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号 SCXK（湘） 2019-0004。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心SPF 级动物房，自由摄食饮水，实验前适应性喂养3d。

1.2 药物左归降糖解郁方（黄芪、贯叶连翘、姜黄、熟地黄、山萸肉、枸杞子、菟丝子、杜仲、丹参、牡丹皮、牛膝），饮片购于湖南中医药大学第一附属医院，并由医学创新实验中心制成原药材浓度为1.14 g/mL 水煎液（黄芪甲苷≥ 30 μg/mL、姜黄素≥ 0.4 mg/mL、贯叶金丝桃素≥ 18 μg/mL、丹酚酸 B≥1.2 mg/mL、丹皮酚≥ 0.2 mg/mL）。动物造模用高脂乳剂（含10%胆固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%猪油、2%胆酸钠、

20%聚山梨酯 80 和 20%丙二醇），医学创新实验中心制备，批号 20200306，-20 ℃冰箱保存，临用前水浴加热融化。

1.3 主要试剂与仪器胰岛素受体拮抗剂（ S961 TFA），上海 MCE公司，批号 68525；链脲佐菌素（ STZ），北京 Solarbio 公司，批号 1012C031；胰岛素受体底物-1（IRS-1）、GAPDH、

Na,K-ATPase α1 抗体，美国 CST 公司，货号分别为

2382、7074、3010；p-IR、、IR p-IRS-1、GLUT4 抗

体，江苏 Affinity Biosciences 公司，货号分别为AF3099、AF6099、AF4424、AF5386；葡萄糖、丙酮酸 ELISA 检测试剂盒，南京建成生物工程公司，货号分别为 F006、A081；胆固醇（ TC）、三酰甘油（ TG）

ELISA 检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号分别为 206021、201651；超敏 ECL试剂盒，苏州新赛美生物科技有限公司，批号 20201201。

ChemiDoc XRS+凝胶成像系统，美国 Bio-Rad 公司； SMART 动物行为学检测系统，美国东乐自然基因生命科学公司； Enspire 多功能酶标仪，美国 PerkinElmer公司。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

采用2周高脂乳剂灌胃（ 10 mL/kg）、一次性 STZ （ 38 mg/kg）尾静脉注射和4周慢性温和不可预知应激的联合造模方法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型[7]。48只大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药（二甲双胍 0.18 g/kg＋氟西汀 1.8 mg/kg）组、左归降糖解郁方高（ 20.52 g/kg）、中（ 10.26 g/kg）、低（ 5.13 g/kg）剂量组，每组8只。给药剂量根据人与大鼠体表面积换算，相当于 60 kg 成人用药量的2、1、0.5 倍，灌胃体积 10 mL/kg，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，连续4周。给药结束后禁食不禁水12 h，尾尖采血测量大鼠空腹血糖，随后进行行为学实验。2.2 旷场实验旷场实验主要观察动物的自主活动行为和探究行为。实验前将敞箱（ 80 cm×80 cm×40 cm）底部划分为 25 个面积相等的方格。实验时依次将大鼠从同一位置放入敞箱中并适应 1 min，记录大鼠 3 min内活动次数。大鼠每经过1个方格或攀爬在箱壁上均记为 1次活动。每只大鼠测评结束后，用消毒纸巾擦拭箱体，以免气味相互干扰。实验过程中保持房间内光线一致且安静。

2.3 强迫游泳实验强迫游泳实验用来评价大鼠的抑郁样行为。将大鼠置于高 40 cm、直径 20 cm的圆柱形玻璃缸内，缸中水位以大鼠伸展全身而尾部不碰触缸底为准，将大鼠放入缸内适应1 min，记录大鼠在3 min 内的不动时间（以大鼠漂浮在水面且四肢不动或四肢轻微划水为静止不动）。实验中注意保证同期实验大鼠之间不可见，以减少干扰。2.4 血清胆固醇和三酰甘油含量检测行为学检测后，所有大鼠禁食过夜，次日上午以

戊巴比妥钠（ 30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取

血， 1 200 r/min 离心 10 min，取上清液，按 ELISA试剂盒说明书检测血清TC 和 TG含量。2.5 葡萄糖代谢检测取血后颈椎脱臼法处死大鼠并于冰上取脑，分离前额叶皮层组织于液氮中速冻，随后转移至-80 ℃冰箱保存。实验前将前额叶皮层置于冰上快速匀浆，

4 ℃、1 200 r/min 离心 10 min，取上清液，按 ELISA试剂盒说明书检测葡萄糖和丙酮酸含量。

2.6 Western blot 检测将样品分别用不同蛋白提取液处理，总蛋白提取液用于检测IR、p-IR、IRS-1、p-IRS-1 蛋白表达，膜蛋白提取液用于检测GLUT4 蛋白表达。BCA法测定蛋白浓度，依次对蛋白进行变性、凝胶电泳、湿式转膜，脱脂牛奶室温封闭1 h，加入稀释的 GLUT4（1∶

2 000）、p-IR（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、IR （ 1∶2 000）、IRS-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）和 Na,K-ATPase α1（1∶1 000）一抗， 4 ℃孵育过夜，

加入二抗（ 1∶3 000），室温孵育1 h，洗膜， ECL 试

剂显色，采用 Image J软件对蛋白条带进行分析。

3 统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示，组间比较采用方差分析，方差齐用LSD 法，方差不齐用 Dunnett- t 检验。P＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果4.1 左归降糖解郁方对模型大鼠血糖、血脂的影响与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖、血清 TC和 TG含量显著增加（ P＜ 0.01， P＜ 0.05）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中剂量组大鼠空腹血糖、血清 TC 和 TG含量显著减少（ P＜ 0.01， P＜ 0.05）。结果见表1。

4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠抑郁样行为的影响与对照组比较，模型组大鼠强迫游泳实验不动时

间显著延长，旷场实验活动次数显著减少（ P＜

0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高剂量组大鼠强迫游泳实验不动时间明显缩短，旷场实验活动次数明显增加（ P＜ 0.01），左归降糖解郁方中剂量组大鼠强迫游泳实验不动时间明显缩短（ P＜ 0.05），旷场实验活动次数无明显变化（ P＞ 0.05）。结果见表2。4.4 左归降糖解郁方对模型大鼠前额叶皮层胰岛素受体、胰岛素受体底物-1蛋白表达的影响与对照组比较，模型组大鼠前额叶皮层 p-IR/IR、

p-IRS-1/IRS-1 比值显著降低（ P＜ 0.01， P＜ 0.05）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中剂量组大鼠前额叶皮层 p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1 比值显著升高（ P＜

0.01， P＜ 0.05）。结果见图1、表4。4.5 左归降糖解郁方对模型大鼠前额叶皮层葡萄糖转运体4蛋白膜表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠前额叶皮层 GLUT4蛋白膜表达显著降低（ P＜ 0.01）；与模型组比较，左归降糖解郁方高、中、低剂量组大鼠前额叶皮层GLUT4蛋白膜表达显著升高（ P＜ 0.01）。结果见图2、表 5。

5 讨论近年来有研究提出，脑胰岛素抵抗是糖尿病和抑郁症的共同病理机制[10]。动物实验发现，转基因糖尿病小鼠存在脑胰岛素信号紊乱，并从5月龄开始表现出明显的抑郁样行为[11]。C57BL/6 小鼠经高脂饲料喂养后也表现出明显的焦虑和抑郁样行为，且与脑胰岛素信号损伤密切相关。糖尿病诱发的中枢胰岛素抵抗会影响脑神经元存活和中枢能量代谢稳态。中枢胰岛