健脾养正消癥汤干预己糖激酶2介导的糖代谢调控胃癌细胞增殖和凋亡

2023-10-15 -

商佳荣，郑侠，钱军南京中医药大学附属医院，江苏南京 210004

摘要：目的基于网络药理学和细胞实验探讨健脾养正消癥汤调控胃癌糖代谢和增殖的作用机制。方法通过TCMSP和SwissTargetPrediction检索健脾养正消癥汤组方药物的有效活性成分并预测其相应靶点， GeneCards数据库预测胃癌的靶基因，筛选出药物靶点和疾病靶点的交集作为关键靶点；对关键靶点构建蛋白相互作用（PPI）网络，并寻找核心基因；应用RStudio进行GO、KEGG、DO富集分析；构建交集网络、中药-活性成分-靶点网络和PPI网络；采用PyMOL软件进行小分子和蛋白对接。利用健脾养正消癥汤大鼠含药血清体外干预胃癌细胞株HGC-27和AGS，流式细胞术检测细胞凋亡，通过检测细胞葡萄糖摄取和乳酸生成分析细胞糖代谢变化，Western blot检测细胞己糖激酶2（HK2）表达。结果健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径的关键化学成分共181种，包括槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚、刺芒柄花素等；关键靶点包括HK2、EGFR、HIF1A、HSP90AA1、ALB等；GO富集结果包括前体代谢物和能量的产生、NADP代谢过程、ATP水解活性等，KEGG富集分析得到碳代谢、HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生、癌症中的中心碳代谢等通路，DO富集分析得到包括胃癌在内多种癌症；分子对接显示，HK2与活性成分具有较强的结合活性。细胞实验表明，与对照组比较，健脾养正消癥汤能显著促进HGC-27、AGS细胞凋亡（P<0.01），下调HK2蛋白表达（P<0.01），减少葡萄糖摄取量和乳酸生成量。结论健脾养正消癥汤可通过多成分、多靶点、多信号通路干预胃癌糖代谢，其中下调HK2表达是其关键。关键词：健脾养正消癥汤；胃癌；糖酵解；网络药理学；己糖激酶2中图分类号：R273.52；R285 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2023)10-0027-09 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202302198 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Effects of Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction on Cell Proliferation and Apoptosis via HK2-mediated Glycometabolism in Gastric Cancer

SHANG Jiarong, ZHENG Xia, QIAN Jun

Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210004, China

Abstract: Objective To explore the action mechanism of Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction in regulating glucose metabolism and proliferation in gastric cancer based on network pharmacology and cell experiment. Methods The active components of the Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction were searched and analyzed in the TCMSP and the SwissTargetPrediction, and the corresponding targets were predicted. Candidate target genes for gastric cancer were identified using online databases such as GeneCards to screen the intersection of drug targets and disease targets as key targets; a PPI network was constructed for key targets and core genes were searched; RStudio was used for GO, KEGG, DO enrichment analysis; intersection networks, Chinese materia medica-component-target networks, and PPI networks were constructed; visual analysis of the small molecules and candidate genes was performed using PyMOL software. Additionally, the prepared serum containing the drug was used to intervene gastric cancer cell lines HGC-27 and AGS in vitro. Flow cytometry was used to detect apoptosis. The changes in cellular基金项目：中医药传承创新平台建设项目（Y2020CS57）；江苏省研究生科研与实践创新计划项目（SJCX23_0799）通讯作者：钱军，E-mail：jun_qian@njucm.edu.cn

glucose metabolism was analyzed by detecting cellular glucose uptake and lactate production. Western blot was used to detect cellular HK2 expression. Results There were 181 key chemical components of Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction that act on the glucose metabolism pathway of gastric cancer, including quercetin, naringenin, glabritin, kaempferol, formononetin, etc. HK2, EGFR, HIF1A, HSP90AA1 and ALB were considered as the most critical targets. The GO enrichment results included the production of precursor metabolites and energy, NADP metabolism process, ATP hydrolysis activity, etc. KEGG enrichment analysis obtained carbon metabolism, HIF-1 signaling pathway, glycolysis/gluconeogenesis, central carbon metabolism in cancer and other pathways. DO enrichment analysis obtained various cancers including gastric cancer. Molecular docking showed that HK2 had strong binding activity with the active components. Cell experiments showed that compared with the control group, Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction could significantly promote apoptosis of HGC-27 and AGS gastric cancer cells (P< 0.01), downregulate the expression of HK2 protein (P<0.01), and reduce glucose uptake and lactate production. Conclusion Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction interferes with gastric cancer glucose metabolism through multicomponents, multi-targets and multi-signaling pathways, of which down-regulation of HK2 expression is the key to its treatment.

Keywords: Jianpi Yangzheng Xiaozheng Decoction; gastric cancer; glycolysis; network pharmacology; hexokinase 2

胃癌是常见消化道恶性肿瘤，根据世界卫生组织数据显示，2020年我国因胃癌死亡人数为37.4万，居我国癌症死亡原因第3位[1]。由于胃癌早期症状不明显，确诊时多为晚期甚至发生转移，五年生存率约

35.1%[2]。近年来，内镜检查、手术、放化疗、免疫和

靶向治疗在胃癌中取得了突破，然而依然存在复发转移率高、药物耐受性等难题，严重影响患者的生存和生活质量。因此，探索高效低毒的药物和精准靶点，提高胃癌治疗的疗效和安全性具有重要意义。

胃癌的发展与细胞能量代谢关系密切，胃癌细胞通过调节葡萄糖摄取、乳酸生成等代谢途径，为其增殖、侵袭、转移及逃逸等创造有利条件，有助于其在肿瘤进展期间无限增殖和存活。胃癌细胞在恶性转化的过程中，细胞的代谢模式从氧化磷酸化转化为糖酵

解以满足更多的能量需求[3]。己糖激酶是糖酵解过程的

第一个限速酶，可磷酸化己糖变为己糖-6-磷酸。已知的己糖激酶有4种（ HK1～HK4），其中己糖激酶2 （HK2）在很多和有氧糖酵解增强有关的肿瘤中表达上调[4]。HK2可加速胃癌细胞对葡萄糖的摄取，促进糖代谢，进而促进癌细胞的增殖和肿瘤进展[5]。因此，抑制胃癌糖代谢途径相关基因、蛋白表达及通路激活，可能是抑制胃癌肿瘤细胞进展的关键。

中医药治疗胃癌等恶性肿瘤不仅能显著改善临床症状，直接发挥抗癌作用，还能联合手术、放化疗、靶向及免疫治疗等发挥增效减毒作用。首届全国名中医刘沈林教授针对胃癌治疗，在汲取前人经验基础上，通过长期临床实践总结，提出“脾虚正衰是病机关键，

癌毒是重要病理因素”，并由《何氏虚劳心传》健脾资生丸及《沈氏尊生书》血癥丸化裁而成健脾养正消癥汤[6]。临床试验显示，健脾养正消癥汤可显著延长胃癌晚期患者生存期，提高其生活质量[7]。然而，对于健脾养正消癥汤治疗胃癌的具体分子生物学机制尚未完全阐明。本研究通过网络药理学方法及实验验证，探索健脾养正消癥汤通过影响糖代谢途径治疗胃癌的分子生物学作用机制，为健脾养正消癥汤的开发和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 健脾养正消癥汤有效成分及靶点获取

通过TCMSP （http://tcmspw. com/tcmsp. php ）检索健脾养正消癥汤11味组方药物“黄芪”“党参”“白术”“当归”“白芍”“陈皮”“三棱”“莪术”“石见穿” “白花蛇舌草”“甘草”的活性成分，以类药性（DL）≥

且口服生物利用度（OB）≥30%

0.18 的化合物作为健脾养正消癥汤有效活性成分，同时收集和整理活性成分对应的靶点。将所得活性成分输入PubChem（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载化学成分标准化格式的 SMILES号，并将其输入 SwissTargetPrediction （http://www.swisstargetprediction.ch/）平台进行靶点预测。根据UniProt（https://www.uniprot.org）数据库对靶点信息进行比对、校正，将SwissTargetPrediction和TCMSP靶点合并、去重，获得活性成分靶点，构建健脾养正消癥汤活性成分靶点数据库。

1.1.2 胃癌糖代谢相关靶点检索

以检索表达式“glycometabolism” AND “gastric cancer ”，在 GeneCards （https://www. genecards. org/ ）数据库检索相关疾病靶点，以Relevance score>1为标准选取疾病靶点，比对UniProt数据库，构建疾病相关靶点数据库。利用Venny （https://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html）映射疾病靶点与健脾养正消癥汤活性成分靶点的交集。1.1.3 中药-活性成分-靶点网络构建

将交集靶点数据导入Cytoscape3.9.1软件（https:// cytoscape.org/），构建中药-活性成分-靶点网络，以直观展现药物活性成分与疾病间相互关系。利用CytoNCA插件对该网络进行拓扑分析，计算节点的度中心性（ degree centrality， DC ）、中介中心性（betweenness centrality， BC ）和接近中心性（closeness centrality，CC）。网络中节点的值越大，相互作用关系就越多，越可能为该网络的关键节点。1.1.4 蛋白相互作用网络构建

基于STRING（https://string-db.org/）数据库获取潜在靶点蛋白相互作用（PPI）关系，设定物种为“Homo Sapiens”（人类），筛选并构建PPI网络。借助Cytoscape对PPI网络进行挖掘分析，基于CytoNCA插件计算PPI网络中各节点的DC、BC、CC进行拓扑分析，选取DC、BC、CC值均高于中位数的靶点作为核心靶点。

1.1.5 GO、KEGG及DO富集分析

运用 RStudio 软件包 ggplot2、 clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db、ggnewscale、pathview对健脾养正消癥汤干预胃癌糖代谢的潜在靶点进行GO、KEGG和DO富集分析。以P<0.05为条件进行筛选，得到健脾养正消癥汤干预胃癌糖代谢的主要功能、通路及相关疾病，并对结果进行可视化处理。

1.1.6 分子对接

借助PubChem数据库，查找健脾养正消癥汤主要活性成分的3D结构，输入 OpenBabel3.1.1 （http:// openbabel.org/），保存为mol2格式。依据RCSB PDB （http://www.rcsb.org/）数据库，查找核心靶点的蛋白晶体结构，利用PyMOL（https://pymol. org/）软件对其进行去水、加氢，并输出为pdb格式。最后使用Autodock Tools（https://autodock.scripps.edu/）软件进行分子对接分析。

1.2 细胞实验验证

1.2.1 动物、试药与仪器

SPF级SD雄性大鼠16只，8～10周龄，体质量

（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK （京） 2012-0001。于温度（20±2）℃、湿度50%±10%、12 h/12 h光暗循环条件下，适应性饲养7 d后开始实验。人胃癌细胞HGC-27、AGS，购于中国科学院上海细胞库，南京中医药大学附属医院中心实验室常规培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素溶液的RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，取对数期细胞进行实验。动物实验

经南京中医药大学附属医院伦理委员会审批

（2020NL-107-1）。

健脾养正消癥汤（党参30 g，黄芪60 g，麸炒白术10 g，炒白芍10 g，当归10 g，石见穿15 g，三棱30 g，莪术30 g，白花蛇舌草15 g，陈皮6 g，甘草5 g）饮片购于南京中医药大学附属医院，加10倍量水常规煎煮，重复煎煮2次，所得药液混合、过滤、灭菌、蒸发、浓缩，使其终浓度为1 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存备用。

10%胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司，批号20010401；1%青-链霉素溶液的RPMI-1640培养基，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号分别为2085154、2240832。葡萄糖测定试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司，批号20181209290；乳酸测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20190603；HK2抗体，美国Proteintech公司，批号66287-1-lg；二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号134293。

1300A2型生物安全柜（美国Thermo公司），IX51型倒置显微镜（日本Olympus公司），ELx800型全自动酶标仪（美国BioTek公司），C6流式细胞仪（美国BD公司），PowerPacTM Basic型电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad 公司），Tanon-5500型化学发光凝胶成像仪（中国天能科技有限公司），HERAcell 1501型CO2培养箱（美国Thermo公司）。

1.2.2 含药血清制备

将16只大鼠随机分为含药血清组和对照血清组。依据预实验结果，根据体表面积计算给药剂量，含药血清组予23.02 g/kg健脾养正消癥汤灌胃，对照血清组予0.9%氯化钠注射液4 mL灌胃，每日2次，连续3 d。第4日禁食不禁水12 h，一次性灌胃全天剂量后1 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置4 h，2 000 r/min离心15 min，

μm分离血清，混合同组血清后，0.22 醋酸纤维素膜过滤2次，56 ℃水浴30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 细胞分组

将 HGC-27、AGS细胞分别分为含药血清组（79%RPMI-1640培养基+20%大鼠含药血清+1%青-链

霉素）和对照血清组（79%RPMI-1640培养基+20%大鼠对照血清+1%青-链霉素）。每组设置3个重复，将细胞置于无血清培养基中培养2h后再进行后续处理。1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期HGC-27、AGS细胞接种至6孔板，根据不同分组采用相应培养基作用48 h，收集HGC-27、AGS细胞，加70%乙醇4℃固定过夜；PBS冲洗2次，加入RNase，37 ℃水浴30 min； PBS再次洗涤2次后，加入碘化丙啶（PI），4℃避光染色30 min，400目滤网过滤1次，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 糖酵解水平检测

HGC-27、AGS细胞根据不同分组采用相应培养基作用48 h，收集HGC-27、AGS细胞，8 000 r/min离心

μm 10 min，收集上清液，经0.22 微孔滤膜过滤，滤液-20 ℃冰箱保存备用。按葡萄糖检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法）、乳酸检测试剂盒说明书检测细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量。

1.2.6 Western blot检测己糖激酶2蛋白表达水平

HGC-27、AGS细胞根据不同分组采用相应培养基作用48 h，加RIPA，于冰上裂解20 min，13 000 r/min离心5 min，吸取上清液，采用蛋白质定量试剂盒（BCA法）测定蛋白浓度。取适量蛋白制胶上样，凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭。2h后用PBS清洗3次，加入稀释后的一抗（1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜。弃一抗液，PBS清洗膜后，加入二抗（1∶ 6 000），室温下振荡孵育1h。清洗膜后，加入ECL液显影，使用凝胶成像系统显影拍照。以Actin为参照，采用Image J软件分析灰度值，计算蛋白相对表达量。1.2.7 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，满足正态分布时，2组间比较采用t检验或非参数检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 健脾养正消癥汤活性成分及靶点

共收集健脾养正消癥汤的活性成分181种，其中黄芪20种、党参24种、白术7种、当归2种、白芍13种、陈皮5种、三棱5种、莪术3种、石见穿3种、白花蛇舌草7种、甘草92种。共得到药物活性成分靶点4 094个，其中黄芪615个、党参511个、白术249个、当归96个、白芍316个、陈皮223个、三棱181个、莪术157个、石见穿290个、白花蛇舌草444个、甘草1 012

个，剔除重复后获得1 179个靶点。

2.1.2 胃癌糖代谢相关靶点

通过GenCards数据库检索与筛选，共获得176个疾病相关靶点，对疾病与药物靶点映射后，选取潜在作用靶点37个。经靶点比对，获得124个活性成分，建立中药成分与靶点关系。

2.1.3 中药-活性成分-靶点网络

借助Cytoscape3.9.1构建中药-活性成分-靶点网络，并应用CytoNCA插件对该网络进行拓扑分析，得到DC中位数为3，BC中位数为44.577 09，CC中位数为0.407 714，三者均大于中位数的节点被认为是该网络的关键节点，前20个节点见表1。健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径主要活性成分见表2。对关键节点中的活性成分构建中药-活性成分-靶点网络，该网络由149个节点和402条边组成，见图1。

表1 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径

中药-活性成分-靶点网络拓扑分析2.1.4 核心基因互作网络

通过STRING对37个潜在基因构建PPI关系，经Cytoscape3.9.1处理，结果见图2。利用Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析，其中BC、CC、DC均大于其中位数的基因共14个，见表3。其中GAPDH、HIF1A、 HSP90AA1、 ALB、 EGFR、 HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2等具有较多的互作关系，选取为核心基因进一步研究靶点的功能。

2.1.5 富集分析结果

通过R语言对健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径的37个潜在靶点进行GO、KEGG和DO富集分析。GO富集分析得到1 016条结果，其中生物过程（BP）900条、细胞组成（CC）63条、分子功能（MF） 113条，主要包括前体代谢物和能量的产生、对营养水平的反应、对细胞外刺激的反应、NADP代谢过程等生物过程，囊泡腔、内质网腔、黑色素体、内质网伴侣复合体等细胞组成，NADP结合、泛素蛋白连接酶结合、ATP水解活性等分子功能。见图3。KEGG通路富集分析得到46条通路，前20条通路见图4，其中碳代谢、HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的中心碳代谢等通路与健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径密切相关。DO富集分析得到200个条目，包括胃癌在内的多种癌症，前20个条目见图5。

图5 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径靶点DO富集分析2.1.6 分子对接

选取3个主要活性成分槲皮素（MOL000098）、柚皮素（MOL004328）、光甘草定（MOL004908）与10个显著表达的基因GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、 EGFR、 HSPA5、 PPARG、 SLC2A1、 HK2、PGK1进行分子对接模拟，结果见图6。通常认为，结合能<0 kcal/mol则小分子配体和受体蛋白能够自发结合，结合能<-5.0 kcal/mol表明结合活性良好[8]。对接