CJI (Traditional Chinese Medicine)
壮腰通络方对椎间盘退变大鼠髓核细胞焦亡的影响
冯蓬1，朱立国1，高春雨1，张威1，高景华1，孙凯1，李路广1，车颖 2，回瑾 1
1.中国中医科学院望京医院，北京 100020；2.山东中医药大学，山东 济南 250355
摘要：目的 观察壮腰通络方对椎间盘退变大鼠髓核细胞焦亡的影响，探讨其延缓椎间盘退变的作用机制。方法 48只SD大鼠随机分为正常组、模型组、依那西普组和壮腰通络方高、中、低剂量组，每组8只，采用针刺尾椎法构建椎间盘退变大鼠模型，壮腰通络方各剂量组分别予相应剂量药物灌胃，连续30 d。ELISA检测大鼠血清肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-18含量，Western blot检测髓核组织聚集蛋白聚糖（aggrecan）和Ⅱ型胶原（collagenⅡ）表达，免疫组化染色检测髓核组织NOD样受体蛋白3 （NLRP3）、胱天蛋白酶（Caspase） -1、核因子-κB （NF-κB） p65和NF-κB抑制蛋白（IκB） -α定位和表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量显著升高（P<0.01），髓核组织aggrecan和collagenⅡ蛋白表达显著降低（P<0.01），髓核组织结构不均匀，多见空泡，NLRP3、Caspase-1和NF-κB p65蛋白表达显著升高，IκB-α蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量显著降低（P<0.05，P<0.01），髓核组织aggrecan和collagenⅡ蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01），髓核组织结构改善，NLRP3、Caspase-1和NF-κB p65蛋白表达显著降低， IκB-α蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。结论 壮腰通络方能下调椎间盘退变大鼠髓核组织NF-κB信号通路相关蛋白表达，抑制髓核细胞焦亡，延缓椎间盘退变。关键词：椎间盘退变；壮腰通络方；细胞焦亡；髓核；NF-κB信号通路；大鼠中图分类号：R274.9；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2023)10-0089-06 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202304188 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Zhuangyao Tongluo Decoction on Pyroptosis of Nucleus Pulposus Cells in Rats with Intervertebral Disc Degeneration
FENG Peng1, ZHU Liguo1, GAO Chunyu1, ZHANG Wei1, GAO Jinghua1, SUN Kai1,
LI Luguang1, CHE Ying2, HUI Jin1
1. Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100020, China;
2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
Abstract: Objective To investigate the effects of Zhuangyao Tongluo Decoction on pyroptosis of nucleus pulposus cells in rats with intervertebral disc degeneration (IDD); To explore its mechanism of delaying IDD. Methods Totally 48 SD rats were randomly divided into normal group, model group, etanercept group, Zhuangyao Tongluo Decoction high, medium- and low-dosage groups, with 8 rats in each group. The model of IDD in rats was constructed by acupuncture on the tail vertebrae. Zhuangyao Tongluo Decoction groups were treated with the corresponding doses of drugs for gavage for consecutive 30 d. ELISA was used to detected the contents of TNF-α, IL-1β and IL-18 in serum, Western blot was used to detected the expressions of aggrecan and collagen Ⅱ in nucleus pulposus tissue, the expressions and localization of NLRP3, Caspase-1, NF-κB p65 and IκB-α in nucleus pulposus tissue were detected by immunohistochemical staining. Results Compared with the normal group, the contents of serum TNF-α, IL-1β, and IL-18 significantly increased (P<0.01), the expressions of aggrecan and collagen Ⅱ proteins in nucleus pulposus tissue significantly decreased in the model group (P<0.01), the structure of nucleus pulposus tissue was基金项目：中国中医科学院望京医院苗圃培育项目（WJYY-YJKT-2022-03）通讯作者：高春雨，E-mail：gaochunyu8526@sina.com
uneven, with frequent vacuoles, the expressions of NLRP3, Caspase-1, and NF- κB p65 protein significantly increased, the expression of IκB-α protein significantly decreased (P<0.01). Compared with the model group, the contents of serum TNF -α, IL-1β and IL-18 of the rats in etanercept group and Zhuangyao Tongluo Decoction highand medium-dosage groups significantly decreased (P<0.05, P<0.01), the expressions of aggrecan and collagen Ⅱ protein in nucleus pulposus tissue significantly increased (P<0.05, P<0.01), the structure of nucleus pulposus tissue was improved, the expressions of NLRP3, Caspase-1, and NF-κB p65 protein significantly decreased, the expression of IκB-α protein significantly increased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Zhuangyao Tongluo Decoction can inhibit the expression of NF-κB signaling pathway in nucleus pulposus tissue of rats with IDD, inhibit the pyroptosis of nucleus pulposus cells, and delay the degeneration of intervertebral disc.
Keywords: intervertebral disc degeneration; Zhuangyao Tongluo Decoction; pyroptosis; nucleus pulposus;
NF-κB signaling pathway; rats
椎间盘退变（ intervertebral disc degeneration， IDD）是导致盘源性腰痛和其他脊柱退行性疾病的主要原因[1]，是大部分脊柱退行性疾病的重要病理基础，往往在MRI影像中被早期识别[2]。国外研究表明，腰痛的终生患病率高达84%，慢性腰痛的患病率约为23%，有11%～12%患者因腰痛致残[3]。随着人们生活方式的改变，腰痛患病率逐年增加且有年轻化趋势，与IDD的病理改变高度相关[4]。
细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种方式。越来越多的研究表明，IDD与髓核细胞（NPCs）焦亡相关，
-α肿瘤坏死因子（TNF） 及其进一步激活的核因子（NF）-κB
信号通路可能是NPCs焦亡的中心环节[5]。在
α、
退变的 NPCs 中， TNF- NOD 样受体蛋白3 （NLRP3）、胱天蛋白酶（Caspase） -1、白细胞介素（IL）-1β
表达显著上调，其水平能够反映NPCs的焦亡程度[6]。焦亡的髓核组织进一步释放炎性介质，诱导炎性细胞浸润，引发炎症级联反应[7]。抑制NLRP3激活可以减少细胞外基质降解，对NPCs起到保护作用，从而缓解IDD。
壮腰通络方是朱立国教授在《外台秘要》腰痛类方的证治特点及用药规律基础上总结而成[8]，具有补益肝肾、活血通络作用，用于治疗脊柱退行性疾病所致腰痛及腰椎功能障碍，临床应用多年，疗效显著[9]。实
验研究发现，该方能降低腰椎间盘退行性病变大鼠血清炎症因子水平，增加椎间盘组织NPCs数量[10]。本研究观察壮腰通络方对IDD大鼠NPCs焦亡的影响，进一步探究其延缓IDD的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
8周龄SPF级雄性SD大鼠48只，体质量（200± 20）g，购于中国食品药品检定研究院，动物生产许可证号SCXK（京）2017-0005。饲养于中国中医科学院
中医基础理论研究所动物房，通风良好，温度20～ 25 ℃，湿度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，自由摄食饮水，动物使用许可证号SYXK（京）2021-0017。本实验经北京隆安实验动物中心伦理委员会审批（BJLongan-L-L-003）。
1.2 药物及制备
壮腰通络方由杜仲、熟地黄、当归、丹参、延胡索、独活、川芎、秦艽、牛膝按15∶15∶12∶12∶10∶ 10∶10∶12∶12比例组成，饮片购于中国中医科学院望京医院中药房，由中国中医科学院望京医院骨伤科研究所制成原药材浓度分别为25.2、12.6、6.3 g/mL浓
α
缩液备用。TNF- 竞争性抑制剂依那西普，美国
≥98.0% MedChemExpress ，纯度 ，货号 HY-108847，使用前用生理盐水配制成1 g/mL溶液。
1.3 主要试剂与仪器
BCA蛋白定量检测试剂盒、RIPA 裂解液、Cocktail蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF、蛋白上样缓冲液、抗体稀释液、ECL试剂盒（武汉Servicebio，货号分别为G2026-200T、G2002-30ML、G2006-250UL、 G2007-1ML、 G2008-1ML、 G20131ML、G2025-100ML、G2014-50ML），中性甲醛（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0099），10%EDTA
G1105），TNF-α、IL-18脱钙液（武汉Servicebio，货号
ELISA试剂盒（英国Abcam，货号分别为ab236712、ab213909），IL-1β
ELISA试剂盒（美国Invitrogen，货ER5RBX5），Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ）抗体（英国号
Abcam，货号ab307674），聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗体（美国Proteintech，货号13880-1-AP），NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκB）-α抗体（武汉 Servicebio ，货号分别为 GB114320、GB11383、GB11997、GB11212）。垂直电泳仪（武汉Servicebio，型号BV-2），病理切片机（上海徕卡仪器
有限公司，型号RM2016），显微镜（日本尼康仪器有限公司，型号E100 ），核磁共振成像系统（德国Siemens，型号MAGNETOM skyra3.0T）。
2 实验方法
2.1 分组及造模
48只大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、依那西普组和壮腰通络方高、中、低剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组采用针刺尾椎法建立IDD模型[11-12]：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，选定
C6-7、C7-8为针刺间隙，消毒皮肤，以26G针头经纤维环水平穿至髓核中，穿入后将针体旋转360°，保持30 s后垂直拔出，无菌棉球按压针孔15 s。分别于第0、14、28日穿刺。
2.2 给药方法和模型评定
于首次造模后次日开始给药，壮腰通络方高、中、低剂量组分别予252、126、63 g/kg壮腰通络方药液灌胃（相当于60 kg成人临床用药量的2、1、0.5倍），灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续30 d。正常组、模型组和依那西普组灌胃等体积生理盐水。依那西普组造模同时于针刺处注射1 mg/mL依那西普溶液，注射体积10 mL/kg，模型组和壮腰通络方高、中、低剂量组注射等体积生理盐水。给药结束后，利用核磁共振成像系统扫描C6-7、C7-8椎间盘和C8-9椎间盘（正常对照），以评估IDD程度。
2.3 取材
给药结束后麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。用镊子和手术刀剔除附着在C6-7椎间盘周围的软组织，使其可清晰分辨椎体和纤维环包裹的椎间盘，使用手术刀尖端轻轻嵌入上软骨终板与椎体界限，并将上软骨终板翘起，可见透明胶冻状髓核组织，无菌小刮匙取出髓核组织，置于离心管中，液氮暂存，用于Western blot检测。在C8-9离断尾椎，将包含的C7-8椎间盘置于4%多聚甲醛中，随后ETDA脱钙处理，制作石蜡切
μm），用于免疫组化染色。
片（4
2.4 指标检测
2.4.1 ELISA检测
取大鼠血清，按ELISA试剂盒说明书操作步骤检TNF-α、IL-1β、IL-18
测 含量。
2.4.2 Western blot检测
将C6-7髓核组织取出，加入RIPA裂解液和蛋白酶
μL，冰上裂解
抑制剂混合液50 15 min，4℃、2 000×g离心5 min，收集上清液，进行BCA蛋白定量，加入蛋
μg蛋白上样缓冲液，95 ℃使蛋白变性。每孔上样20
白，恒压250 V电泳22 min，恒流300 mA转膜45 min。
aggrecan、collagenⅡ一抗（1∶1
加 000），4℃孵育过夜，加二抗，室温孵育1 h， ECL发光液显影，以GAPDH为内参，Image J 1.5.0软件分析蛋白相对灰度值。2.4.3 免疫组化染色
C7-8椎间盘石蜡切片脱蜡至水，进行热抗原修复，自然冷却，切片置于PBS（pH7.4）中脱色，3%过氧化氢室温避光孵育25 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加3%BSA，室温封闭30 min。甩掉封闭液，滴加NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α
一抗（均为1∶1 000），湿盒内4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，每次 5 min ，滴加二抗（ 1∶ 200 ），室温孵育50 min。DAB显色，苏木素复染，400倍视野下观察结果。采用Image J 1.5.0软件对切片进行分析，以平均光密度评价表达强度。
3 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以xˉ±s
表示，满足正态性，组间比较用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Tamhane's T2法；不满足正态性，组间比较用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组大鼠椎间盘退变程度评估
正常组大鼠C6-7和C7-8椎间盘信号均一，未见退变征象；模型组、依那西普组和壮腰通络方高、中、低剂量组与正常对照比较，C6-7和C7-8椎间盘信号明显变黑，提示C6-7和C7-8发生IDD。见图1。注：A.正常组；B.模型组；C.依那西普组；D.壮腰通络方高剂量组；
E.壮腰通络方中剂量组；F.壮腰通络方低剂量组；ctrl.正常对照
图1 各组大鼠椎间盘核磁共振T2加权像
4.2 壮腰通络方对模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-18含量的影响TNF-α、IL-1β、与正常组比较，模型组大鼠血清
IL-18含量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，依
TNF-α、那西普组和壮腰通络方高、中剂量组大鼠血清β
IL-1 、IL-18含量显著降低（P<0.05，P<0.01），壮腰α
通络方低剂量组TNF- 含量显著降低（ P<0.01）。见表1。
含量比较（xˉ±s，pg/mL）
表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18
注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
4.3 壮腰通络方对模型大鼠髓核组织聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组aggrean、collagenⅡ蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。见图2、表2。注：A.正常组；B.模型组；C.依那西普组；D.壮腰通络方高剂量组； E.壮腰通络方中剂量组；F.壮腰通络方低剂量组
图2 各组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白免疫印迹表2 各组大鼠髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达比较（xˉ±s）注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
4.4 壮腰通络方对模型大鼠髓核组织NOD样受体蛋白3、胱天蛋白酶-1、核因子-κB p65和核因子-κB抑制蛋白-α表达的影响
NLRP3和Caspase-1主要定位在NPCs细胞质和细胞核，NF-κB p65、IκB-α
主要在NPCs细胞质表达。正κB常组有少量NLRP3、Caspase-1、NF- p65 表达， IκB-α表达较高；模型组和壮腰通络方低剂量组髓核组织结构紊乱，可见NPCs焦亡后残留的空泡，壮腰通络方高、中剂量组空泡显著减少，髓核组织结构有所恢
复。与正常组比较，模型组大鼠髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB 蛋白表达显著升高，IκB-α
p65 蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，依那西普组和壮腰通络方高、中剂量组大鼠髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表达显著降低，IκB-α蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。见图3～图7。
5 讨论
IDD临床表现以腰痛和腰椎功能障碍为主，可归属中医学“腰痛”“腰腿痛”“痹证”范畴，属慢性筋伤骨病。腰部主要有肝经、肾经和膀胱经贯穿，肝主疏泄，肾主藏精纳气。《素问·痿论篇》言“宗筋主束骨而利机关也”，肝肾亏虚导致腰部筋脉失去濡养，使腰部筋骨松弛难以御邪。风、寒、湿是常见侵袭腰部的外来邪气。肝肾亏虚状态下，风、寒、湿邪气乘虚而入，最易伤及腰部筋脉，使本就缺乏濡养的筋脉更加瘀阻，最终导致腰痛。聚焦于临床最为常见的肝肾亏虚、瘀血阻络证型，壮腰通络方以补益肝肾、活血通络为纲，标本兼治。方中杜仲、熟地黄、当归、牛膝滋补肝肾、补血养血，固护肝肾之本；延胡索、川芎、丹参重在行气、活血、通络；独活、秦艽祛风除湿、和血舒筋，祛除筋脉中瘀阻的风、寒、湿邪。NPCs焦亡是炎症小体激活引发的细胞程序性死
NF-κB
亡，与 信号通路密切相关，是IDD的主要表型改变[13-14]。当 IDD发生时，髓核失去内环境稳态， TNF-α NF-κB信号通路，NF-κB
激活NPCs的 p65合成增加，同时IκB-α泛素化降解程序激活，促进NF-κB
p65作为转录因子参与焦亡蛋白合成，最终增加NLRP3炎
IL-1β
性小体合成及 和IL-18前体合成[15-18]。NLRP3炎性小体通过多种途径诱导细胞焦亡，其中诱导Caspase-1前体的自剪切并成熟是最经典的细胞焦亡途径[15]。成
D、IL-1β和IL-18熟的Caspase-1进一步剪切Gasdermin前体蛋白使其活化，活化的Gasdermin D释放N端结构域，该结构域结合膜脂并打开细胞膜，导致细胞渗透
IL-1β
压变化，成熟的 和IL-18释放到细胞外，引发炎症瀑布，形成NPCs焦亡恶性循环[15，17]。因此，抑制NPCs焦亡可能是抑制髓核炎症瀑布，阻断NPCs焦亡恶性循环，进而延缓IDD的有效措施[19]。本研究从NPCs焦亡角度探索壮腰通络方治疗IDD的作用机制：首先，ELISA结果表明，壮腰通络方能降低IDD大鼠
TNF-α、IL-1β、IL-18
血清炎症因子 含量，表明壮腰通络方能够显著降低髓核炎症水平，推测其参与了焦亡
IL-1β
关键蛋白 和IL-18合成及分泌；其次，Western blot结果表明，壮腰通络方能上调髓核组织aggrean、collagenⅡ蛋白表达，二者具有保持髓核水分、维持正常代谢、平衡椎间盘应力的作用，有助于维持髓核的基本生物学功能和抑制内环境诱导的细胞焦亡；最后，免疫组化染色结果显示，壮腰通络方能抑制髓核组织NLRP3、Caspase-1、NF-κB IκB-α p65蛋白表达，促进
NF-κB信蛋白表达，表明壮腰通络方通过抑制NPCs的号通路激活抑制NLRP3炎性小体合成和Caspase-1成熟。综上所述，壮腰通络方能够显著抑制NPCs焦亡，
NF-κB
延缓IDD，其机制可能与抑制髓核组织 信号通路，限制NLRP3炎性小体和Caspase-1活化有关。本研究进一步明确了壮腰通络方治疗IDD的作用机制，但其具体机制仍有很大探索空间。前期研究发现，髓
TNF-α核是免疫豁免器官，诱导NPCs焦亡的 并非NPCs本身分泌，而是以M1型巨噬细胞为主导的免疫
[18]
细胞合成并分泌 ，M1型巨噬细胞既是退变髓核的主要炎性细胞类型，也是NPCs焦亡恶性循环的始动因素。因此，壮腰通络方是否能对M1型巨噬细胞产生调控作用以限制NPCs焦亡恶性循环，是课题组今后研究的方向。
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（收稿日期：2023-04-09） （修回日期：2023-05-30；编辑：郑宏）