CJI (Traditional Chinese Medicine)
麻黄细辛附子汤对尘螨变应原Der p1诱导的鼻黏膜上皮细胞屏障损伤的影响
倪钰莹，范淑月，崔颖，高婧，罗再奕，刘敏北京中医药大学，北京 100029
摘要：目的 基于RhoA/ROCK信号通路探讨麻黄细辛附子汤及麻黄对尘螨变应原Der p1诱导的人鼻黏膜上皮细胞（HNEpC）屏障损伤的影响及作用机制。方法 体外培养HNEpC，将细胞分为对照组、模型组、麻黄组、抑制剂组及麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组。电阻仪检测细胞跨膜电阻，酶标仪检测FITCDextran通透性，倒置显微镜观察细胞形态，Western blot检测紧密连接蛋白咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白1 （Claudin-1）及通路蛋白RhoA、ROCK1表达，免疫荧光染色检测肌动蛋白（F-actin）表达。结果 与对照组比较，模型组细胞间隙增大，出现环形损伤，标准化跨膜电阻显著降低（P<0.01），FITC-Dextran通透性显著增加（P<0.01），Occludin、Claudin-1蛋白表达显著降低（P<0.01），RhoA、ROCK1、F-actin蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，麻黄组、抑制剂组和麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组细胞排列紧密，环形损伤被修复，标准化跨膜电阻显著升高（ P<0.01）， FITC-Dextran 通透性显著降低（ P<0.01）， Occludin、Claudin-1蛋白表达显著升高（P<0.01），RhoA、ROCK1蛋白表达显著降低（P<0.01），麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组和抑制剂组细胞F-actin蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 麻黄细辛附子汤及麻黄可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善鼻黏膜通透性，修复Der p1诱导的HNEpC屏障损伤。关键词：变应性鼻炎；麻黄细辛附子汤；屏障功能；RhoA/ROCK信号通路；人鼻黏膜上皮细胞中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2023)10-0101-07 DOI：10.19879/j.cnki.1005-5304.202210385 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Mahuang Xixin Fuzi Decoction on Dust Mite Allergen Der p1-induced Barrier Damage in Nasal Epithelial Cells NI Yuying, FAN Shuyue, CUI Ying, GAO Jing, LUO Zaiyi, LIU Min
Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
Abstract: Objective To explore the effects and mechanism of Mahuang Xixin Fuzi Decoction and Ephedrae Herba on dust mite allergen Der p1-induced barrier damage in human nasal epithelial cells (HNEpC) based on RhoA/ ROCK signaling pathway. Methods HNEpC were cultured in vitro. The cells were divided into control group, model group, Ephedrae Herba group, inhibitor group, and Mahuang Xixin Fuzi Decoction low-, medium-, high-dosage groups. Transepithelial resistance (TER) was measured by using the resistance measuring, FITC-Dextran permeability was detected by enzyme-labeled instrument, cell morphological changes were observed by inverted microscopy, Western blot was used to detect the expression levels of tight junction protein Occludin, Claudin-1, pathway protein RhoA and ROCK1, immunofluorescence staining was used to detect F-actin expression. Results Compared with the control group, the model group showed an increased cell gap, ring damage, significantly lower TER (P<0.01), significantly increased FITC-Dextran permeability (P<0.01), significantly lower Occludin and Claudin-1 protein expressions (P< 0.01), and significantly higher RhoA, ROCK1, and F-actin protein expressions (P<0.01). Compared with the model group, cells were tightly arranged in Ephedrae Herba group, inhibitor group, and Mahuang Xixin Fuzi Decoction基金项目：国家自然科学基金（81774375）通讯作者：刘敏，E-mail：liumin78@126.com
low-, medium-, high-dosage groups, ring damage was repaired, TER was significantly higher (P<0.01), FITCDextran permeability was significantly lower (P<0.01), Occludin and Claudin-1 protein expressions were significantly higher (P<0.01), RhoA and ROCK1 protein expressions significantly decreased (P<0.01), F-actin protein expression significantly decreased in Mahuang Xixin Fuzi Decoction low-, medium-, high-dosage groups and the inhibitor group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Mahuang Xixin Fuzi Decoction and Ephedrae Herba may improve nasal mucosal permeability and repair Der p1-induced HNEpC barrier damage by inhibiting the RhoA/ROCK signaling pathway.
Keywords: allergic rhinitis; Mahuang Xixin Fuzi Decoction; barrier function; RhoA/ROCK signaling pathway;
HNEpC
变应性鼻炎（allergic rhinitis， AR ）是由IgE 介导、Th2细胞驱动、针对吸入性变应原反应引起的鼻黏膜炎症性疾病[1]。诱发AR的因素主要有尘螨、花粉、霉菌等[2]。鼻黏膜上皮细胞是抵御病原体入侵和过敏原渗透的第一道生理屏障。紧密连接位于上皮细胞顶端，参与细胞旁运输的调节，对维持上皮屏障功能具有关键作用[3]。上皮屏障受损可以促进上皮细胞的旁转运，增加变应原渗入，诱导IgE产生，触发肥大细胞脱颗粒，从而导致AR发生发展[4]。RhoA/ROCK信号通路参与调节多种细胞功能，如细胞收缩、黏附、迁移等[5]。RhoA/ROCK通路激活可以诱导细胞周围F-肌动蛋白（F-actin）细胞骨架的动态重组和收缩，改变紧密连接的结构和功能，增加细胞旁通透性[6]。因此，保护
上皮细胞屏障功能以减少变应原渗入可能是防治AR的重要策略。
AR属中医学“鼻鼽”“鼽嚏”等范畴，病机多为肺经感寒、肾阳虚衰。麻黄细辛附子汤出自《伤寒论》，由麻黄、细辛、附子组成，有散寒通窍、温阳固表之效，对防治AR效果显著[7-8]。麻黄轻扬发散，善宣肺气、开腠理、透毛窍，是治疗AR常用药。课题组前期研究发现，麻黄细辛附子汤在AR适应性免疫方面，可以调控T细胞细胞因子和转录因子表达，逆转Th2偏移，恢复Th1/Th2动态平衡[9-10]；在固有免疫方面，可以下调树突状细胞抗原提呈能力[11-12]，抑制2型固有淋巴细胞功能发挥[13]。此外，在麻黄细辛附子汤及其拆方干预T细胞研究中发现，麻黄单用也具有显著免疫调节作用[9]。本实验通过尘螨变应原Der p1诱导鼻黏膜上皮细胞屏障损伤，进一步探讨麻黄细辛附子汤及麻黄的屏障保护作用及其潜在机制，为临床治疗AR提供实验依据。
1 实验材料
1.1 细胞
人鼻黏膜上皮细胞（HNEpC）由北纳生物提供，货号356247。
1.2 药物及制备麻黄细辛附子汤由麻黄、细辛、附子按6∶3∶9比例组成，饮片购于北京仟草中药饮片有限公司。常规方法煎煮，浓缩，制成1 g/mL水煎液，4℃、12 000×g
μm
离心30 min，收集上清液，0.22 滤器过滤后置于-20 ℃冰箱保存备用。称取适量麻黄，同法制成1 g/mL麻黄水煎液，离心，过滤后于-20 ℃冰箱保存备用。1.3 试剂与仪器
MEM培养基（上海逍鹏生物公司，货号C3050），胎牛血清（美国HyClone公司，货号SH30406.05），不含酚红 MEM培养基（武汉普诺赛公司，货号PM150418），尘螨变应原Der p1（美国Greer Lab，货号 XPB91D3A2.5）， ROCK 抑制剂 Y-27632 （美国Selleck公司，货号S1049），FITC-Dextran（上海源叶生物，货号S28503），CCK-8试剂盒（北京兰博利德公司，货号CK001），BCA蛋白定量试剂盒（江苏凯基生物，货号KGP902），咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白1 （Claudin-1 ）抗体（北京博奥森生物公司，货号bs-10011R、bsm-52037M），RhoA、ROCK1抗体（武汉三鹰生物，货号10749-1-AP、21850-1-AP），抗荧光衰减封片剂（北京索莱宝，货号S2110）。二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo公司，型号3111），Millicell电阻测量仪（美国Millipore公司，型号ESR-2），酶标仪（美国Thermo公司，型号Varioskan LUX），荧光显微镜（美国Echo公司，型号Revolve），化学发光成像系统（上海天能公司，型号5200）。
2 实验方法
2.1 造模浓度及时间筛选
HNEpC以MEM完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗），置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞，接种于Transwell板，将细胞分为对照组和Der p1组，待细胞融合至单层后，PBS清洗2遍，换不含血清培养基饥饿培养12 h，对照组正常培养，Der p1组加入终浓度为1、
μg/mL
5、10 Der p1（基础培养基配制）培养1、6、12、24 h，检测细胞标准化跨膜电阻（TER）及FITCDextran通透性，确定造模浓度及造模时间。
2.2 CCK-8法筛选最佳干预浓度
将HNEpC以5×104个/孔接种于96孔板中，置培养箱中培养24 h。空白组只加培养基不含细胞，对照组加入培养基正常培养，麻黄细辛附子汤组和麻黄组分别加入0.5、1、2、5、10 mg/mL麻黄细辛附子汤或麻黄水煎液（基础培养基配制）培养24 h。每孔加入CCK-8
μL，培养箱内避光孵育
溶液10 30 min，酶标仪波长450 nm处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活率。存
给药组-A 对照组-A活率（%）=（A 空白组）÷（A 空白组）×100%。2.3 细胞分组及处理
将细胞分为对照组、模型组、麻黄组、抑制剂组和麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组，每组3个复孔。
μg/mL对照组正常培养，其余各组加入10 Der p1造模，麻黄组同时加入0.5 mg/mL麻黄水煎液，抑制剂组
μmol/L
造模前加入10 Y-27632预处理4 h，麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组造模同时加入0.5、1、2 mg/mL麻黄细辛附子汤水煎液，分别置于培养箱中培养24 h，显微镜下观察细胞形态变化。
2.4 细胞跨膜电阻测定
HNEpC以 1.5×105个/孔接种于12 孔Transwell 上
μL，下室加入
室，每孔500 1 mL完全培养基，待细胞融合成单层后，饥饿培养12 h，再按“2.3”项下方法处理，另设2个空白孔（只含培养基、不含细胞）。干预结束后，细胞电阻仪检测电阻值，计算TER。TER= （测定电阻值-空白电阻值）×有效滤膜面积（1.12
cm2）。实验结果以标准化TER （实验组TER÷对照组TER× 100%）表示。
2.5 FITC-Dextran通透性测定
HNEpC以5×104个/孔接种于24孔Transwell上室，
μL，下室加入 μL
每孔200 500 完全培养基，待细胞融合成单层后，饥饿培养12 h，再按“2.3”项下方法处
μL
理，上室加入200 0.5 mg/mL FITC-Dextran（不含
μL
酚红MEM培养基配制），下室加入500 不含酚红MEM培养基，培养箱内孵育2h。分别从每孔上、下室
μL
取100 液体加入黑色96孔板内，酶标仪激发波长495 nm、发射波长520 nm检测荧光值，计算 FITCDextran通透性[14] （实验组荧光值÷对照组荧光值× 100%）。
2.6 Western blot检测
HNEpC以1×106个/孔接种于6孔板，待细胞融合成单层后，饥饿培养12 h，再按“2.3”项下方法处μL理。PBS清洗2次，每孔加入150 裂解液，冰上裂解5 min，14 000×g离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。上样，电泳，转膜，封闭，加Occludin （1∶2 000）、Claudin-1（1∶1 000）、RhoA（1∶1 000）、000）、β-actin（1∶5 ROCK1（1∶2 000）一抗，4℃孵育过夜，加二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，洗膜，ECL显影液显影，Image J软件分析目的蛋白灰度值。
2.7 免疫荧光检测F-actin表达
HNEpC以2×105个/孔接种于24孔板，待细胞融合成单层后，饥饿培养12 h，再按“2.3”项下方法处理。PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton μL
X-100通透10 min，每孔加入300 罗丹明标记鬼笔环肽，室温避光孵育30 min，滴加抗荧光衰减封片剂，荧光显微镜下观察并拍照，Image J软件分析F-actin荧光强度。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以xˉ±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模条件确定μg/mL与对照组比较，5、10 Der p1处理HNEpC μ
6、12、24 h后标准化TER显著降低，以10 g/mL Der p1处理24 h标准化TER降低最显著（P<0.01）。见表1。μg/mL与对照组比较，5、10 Der p1处理HNEpC 24 h μg/mL后FITC-Dextran通透性显著增加，以10 Der p1增加最显著（P<0.01），见表2。综合TER及FITC-Dextran μg/mL通透性结果，后续选用10 Der p1处理24 h作为造模条件。
表1不同浓度Der p1处理不同时点的HNEpC标准化TER比较（xˉ±s，%，n=3）
4.2 麻黄细辛附子汤及麻黄最佳干预浓度筛选CCK-8结果表明，与对照组比较，麻黄细辛附子汤浓度在0～2 mg/mL时对细胞存活率无影响，浓度为5、10 mg/mL时细胞存活率显著降低（P<0.05，P<0.01）。因此后续采用0.5、1、2 mg/mL作为麻黄细辛附子汤低、中、高剂量进行干预。与对照组比较，1 mg/mL麻黄组细胞存活率有降低趋势，但差异无统计学意义（P> 0.05），2 mg/mL麻黄组细胞存活率显著降低（P<0.01），因此后续采用0.5 mg/mL麻黄进行干预。见表3。表3 不同浓度麻黄细辛附子汤及麻黄对HNEpC存活率的影响（xˉ±s，%）
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
4.3麻黄细辛附子汤对人鼻黏膜上皮细胞形态的影响
对照组HNEpC排列紧密，模型组HNEpC排列疏松，间隙增大，上皮完整性破坏，出现环形损伤；麻黄组、抑制剂组和麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组HNEpC排列较紧密，上皮损伤明显修复。见图1。注：A.对照组；B.模型组；C.麻黄细辛附子汤低剂量组；D.麻黄细辛附子汤中剂量组；E.麻黄细辛附子汤高剂量组；F.麻黄组；G.抑制剂组图1 各组HNEpC形态（标尺=100 μm）
4.4 麻黄细辛附子汤对人鼻黏膜上皮细胞跨膜电阻的影响
与对照组比较，模型组HNEpC标准化TER显著降低（P<0.01）；与模型组比较，麻黄组、抑制剂组和麻
黄细辛附子汤低、中、高剂量组HNEpC标准化TER显著升高（P<0.01）。见表4。4.5麻黄细辛附子汤对人鼻黏膜上皮细胞通透性的影响
与对照组比较，模型组HNEpC FITC-Dextran通透性显著增加（P<0.01）；与模型组比较，麻黄组、抑制剂组和麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组HNEpC FITCDextran通透性显著降低（P<0.01），以麻黄细辛附子汤高剂量组效果最显著（P<0.05，P<0.01）。见表5。通透性比较（xˉ±s，%）
表5 各组HNEpC FITC-Dextran
注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与麻黄细
辛附子汤高剂量组比较，#P<0.05，##P<0.01
4.6 麻黄细辛附子汤对人鼻黏膜上皮细胞咬合蛋白、闭合蛋白-1、RhoA、ROCK1蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组细胞Occludin、Claudin-1蛋白表达显著降低，RhoA、ROCK1蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，麻黄组、抑制剂组和麻
黄细辛附子汤低、中、高剂量组细胞 Occludin、Claudin-1蛋白表达显著升高，RhoA、ROCK1蛋白表达显著降低（P<0.01），以麻黄细辛附子汤高剂量组效果最显著（P<0.05，P<0.01）。见图2、表6。注：A.对照组；B.模型组；C.麻黄细辛附子汤低剂量组；D.麻黄细辛附子汤中剂量组；E.麻黄细辛附子汤高剂量组；F.麻黄组；G.抑制剂组图2 各组HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白免疫印迹
4.7 麻黄细辛附子汤对人鼻黏膜上皮细胞F-肌动蛋（P<0.01）；与模型组比较，麻黄细辛附子汤低、中、白表达的影响高剂量组和抑制剂组细胞F-actin表达显著降低（P<
与对照组比较，模型组细胞F-actin表达显著升高0.05，P<0.01）。见图3、表7。5 讨论AR是发生在鼻黏膜的2型炎症反应。鼻黏膜上皮细胞作为鼻腔的免疫屏障，参与先天免疫及适应性免疫，发挥重要的防御作用[15]。接触变应原后，上皮屏障损伤，通透性增加，促进上皮源性细胞因子及趋化因子释放，启动适应性免疫，激活多种效应细胞，释放炎症介质，进一步造成屏障损伤[16]。屏障损伤与2型炎症反应相互促进，在AR过程中形成恶性循环[17-18]。麻黄细辛附子汤中麻黄散寒邪而发表，附子温肾阳而
补虚，细辛通彻表里，为麻附之臂助。三药合用，补
散兼施，对于AR标本兼治，疗效持久。鼻黏膜上皮细
胞处于机体浅表位置，是整个变态反应的始动环节，
麻黄气味俱薄，轻清而浮，能行周身肌表，是否对屏
障功能有干预作用需通过实验确证。细胞间连接完整性是维持黏膜屏障的关键因素，紧密连接位于细胞间连接顶部，介导细胞黏附，封闭细胞间隙，严格调控离子、水和各种分子的细胞旁运
输[3]。Occludin、Claudin-1是紧密连接的关键蛋白。
Occludin调节紧密连接渗漏途径，允许较大分子通过， Claudin-1调节紧密连接孔道途径，负责小分子和离子的通透性[19]。研究表明，AR患者鼻黏膜上皮部分紧密连接蛋白表达水平降低，黏膜通透性增加[20]。TER可反映跨上皮细胞离子流量大小，TER增加表明离子渗透性降低[21]。不同右旋糖酐（Dextran）可用于检测溶质和大分子的通透性[22]。TER及FITC-Dextran通透性常用于评价上皮屏障功能。F-actin是细胞骨架的关键组分，参与调节多种细胞的高通透性[23-24]。F-actin细
胞骨架与Occludin、Claudin-1等蛋白相连，共同维持
屏障稳定性[25]。RhoA/ROCK信号通路在调控肌动蛋白动力学及其他生物过程中发挥核心作用[26]。RhoA-GTP能激活ROCK，促进F-actin表达及重新排布，增加细胞张力，导致细胞收缩及细胞旁间隙的形成[27-28]。此外，F-actin重排可使紧密连接复合物稳定性破坏，细胞间连接受损，屏障结构及功能异常[29]。RhoA/
ROCK除调控F-actin引起屏障损伤外，还可直接磷酸化紧密连接蛋白，并在连接结构基本保持不变的情况下增加溶质渗透性[30]。Y-27632是一种选择性Rho激酶抑制剂，通过与ATP竞争Rho激酶催化结构域的ATP结合位点抑制Rho激酶活化[31]。
本实验选用常见过敏原Der p1构建HNEpC屏障损伤模型，经麻黄细辛附子汤、麻黄、抑制剂干预后， TER升高，FITC-Dextran通透性降低，细胞排列紧密，环形损伤修复，紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1表达升高，表明麻黄细辛附子汤、麻黄、抑制剂对Der p1引起的屏障损伤均具有修复作用，以高剂量麻黄细辛附子汤效果最为显著。为探索麻黄细辛附子汤及麻黄发挥屏障保护作用的机制，进一步以RhoA/ROCK信号通路为切入点，检测通路关键蛋白RhoA、ROCK1及下游蛋白F-actin表达。结果显示，麻黄细辛附子汤能降低RhoA、ROCK1、F-actin表达，而麻黄可降低RhoA、ROCK1表达，结合全方对紧密连接蛋白的优势调节作用，一定程度上可以反映方药配伍的科学性。但该结果也可能与实验中所设麻黄药物浓度有关，今后可设置不同浓度的麻黄组，进一步对比全方与麻黄单味药的作用差异。
综上所述，麻黄细辛附子汤及麻黄能有效修复Der p1诱导的鼻黏膜上皮细胞屏障损伤，其作用可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路，减少F-actin聚集、收缩、重排，上调紧密连接蛋白表达，降低上皮通透性实现的。本实验中麻黄细辛附子汤及麻黄屏障保护作用显著，可深入探索其配伍机制及药效物质基础。此外，鼻黏膜上皮细胞与其他免疫细胞的关系也具有潜在研究价值。
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（收稿日期：2022-10-31） （修回日期：2022-11-16；编辑：郑宏）