CJI (Traditional Chinese Medicine)
延龄草皂苷对脑缺血大鼠梗死灶周围皮层少突胶质细胞GSK-3/β-catenin/CRMP2信号表达的影响
庄雨明,杨乐,欧阳俊摇,邹海艳,冯雪枫,陆允,李明聪,赵晖
首都医科大学中医药学院,中医络病研究北京市重点实验室,北京 100069
摘要:目的 观察延龄草皂苷(TSTT)对脑缺血大鼠梗死灶周围皮层少突胶质细胞GSK-3/β-catenin/ CRMP2信号表达的影响,探讨其改善脑缺血损伤的作用机制。方法 采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组和金纳多组,各给药组灌胃相应药物,连续15 d。HE染色观察脑组织病理变化,LFB染色观察脑组织神经纤维损伤,免疫荧光染色检测梗死灶周围皮层2′,3′-环核苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)、蛋白聚糖(NG2)、糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)表达,实时荧光定量PCR检测梗死灶周围皮层GSK-3、β-catenin、脑衰蛋白反应调节蛋白-2 (CRMP2)基因表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠患侧脑组织明显坏死,神经细胞大量死亡,胞体皱缩,单位面积神经细胞数量显著减少(P<0.01),神经纤维丢失、排列混乱,髓鞘中有大量空泡,神经纤维相对积分光密度显著减少(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65、33 mg/kg组大鼠神经细胞形态有所改善,单位面积神经细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.01),神经纤维排列较有序,髓鞘中空泡较少,神经纤维相对积分光密度显著增加(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层 CNPase阳性表达显著降低,NG2阳性表达显著升高(P<0.01),NG2/GSK-3β、NG2/β-catenin、CNPase/ GSK-3β、CNPase/β-catenin阳性细胞显著增加(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65、33 mg/kg组大鼠梗死灶周围皮层CNPase、NG2表达显著升高,CNPase/GSK-3β、NG2/GSK-3β阳性细胞显著减少,CNPase/β-catenin、NG2/β-catenin阳性细胞显著增加(P<0.05,P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3α mRNA表达显著升高(P<0.05), β-catenin、CRMP2 mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,TSTT 65 mg/kg组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3α、GSK-3β mRNA表达显著降低,β-catenin和CRMP2 mRNA表达显著升高(P<0.05)。结论 TSTT可减轻脑缺血大鼠脑组织损伤,保护少突胶质细胞,促进少突胶质前体细胞存活,其机制可能与下调GSK-3表达,上调β-catenin、CRMP2表达有关。关键词:延龄草皂苷;脑缺血;少突胶质细胞;少突胶质前体细胞;GSK-3/β-catenin/CRMP2信号通路中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2023)10-0108-08 DOI:10.19879/j.cnki.1005-5304.202209603 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Effects of Total Saponin of Trillium tschonoskii Maxim. on Expression of GSK-3/β-catenin/CRMP2 Signal in Oligodendrocytes in Peri-infarct Cortex of Rats with Cerebral Ischemia
ZHUANG Yuming, YANG Le, OUYANG Junyao, ZOU Haiyan, FENG Xuefeng, LU Yun, LI Mingcong, ZHAO Hui School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University;
Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, Beijing 100069, China
Abstract: Objective To investigate the effects of total saponin of Trillium tschonoskii Maxim. (TSTT) on the expression of GSK-3/β-catenin/CRMP2 signal in oligodendrocytes in peri-infarct cortex of cerebral ischemia rats; To explore its mechanism of improving cerebral ischemia injury. Methods Rat model of middle cerebral artery基金项目:北京市教育委员会科技发展计划面上项目(KM201510025011)通讯作者:赵晖,E-mail:zhaohuishouyi@ccmu.edu.cn
occlusion was established with a suture method. The rats were randomly divided into sham-operation group, model group, Ginaton group and TSTT 65 and 33 mg/kg groups. The medicated groups received gavage with corresponding drugs for 15 consecutive days. HE staining was used to observe the histopathologic changes in brain tissue, LFB staining was used to observe the damage of nerve fibers, immunofluorescence staining was conducted to observe the changes of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), proteoglycan (NG2), glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and β-catenin in peri-infarcted cortex, RT-qPCR was used to detect GSK-3, β-catenin and CRMP2 gene expression in peri-infarcted cortex. Results Compared with the sham-operation group, the brain tissue of the affected side in the model group was necrotic, nerve cells died in large numbers, cell bodies shrunk, the number of nerve cells per unit area significantly reduced (P<0.01), nerve fibers were lost and disordered, there were a large number of vacuoles in the myelin sheath, and the relative integrated optical density of nerve fibers significantly reduced (P< 0.01). Compared with the model group, the morphology of nerve cells was improved in TSTT 65 and 33 mg/kg groups, the number of nerve cells per unit area significantly increased (P<0.05, P<0.01), the nerve fibers were arranged in order, the number of myelin hollow vacuoles was low, and the relative integrated optical density of nerve fibers significantly increased (P<0.01). Immunofluorescence staining results showed that compared with the shamoperation group, the expression of CNPase significantly decreased and the expression of NG2 significantly increased (P<0.01), the number of NG2/GSK-3β, NG2/β-catenin, CNPase/GSK-3β and CNPase/β-catenin positive cells in periinfarcted cortex significantly increased in model group (P<0.01). Compared with the model group, the expressions of CNPase and NG2 in peri-infarcted cortex significantly increased in TSTT 65 and 33 mg/kg groups, the number of CNPase/GSK-3β and NG2/GSK-3β positive cells decreased, the number of CNPase/β-catenin and NG2/β-catenin positive cells increased significantly (P<0.05, P<0.01). RT-qPCR results showed that compared with the sham-operation group, the expression of GSK-3α mRNA in peri-infarcted cortex significantly increased in the model group (P<0.05), while the expressions of β-catenin and CRMP2 mRNA significantly decreased (P<0.05, P< 0.01); compared with the model group, the expression of GSK-3α and GSK-3β mRNA in peri-infarcted cortex significantly decreased in TSTT 65 mg/kg group, and the expression of β-catenin and CRMP2 mRNA significantly increased (P<0.05). Conclusion TSTT can reduce brain tissue damage, protect oligodendrocytes, and promote the survival of oligodendrocyte precursor cells in rats with cerebral ischemia. Its mechanism may be related to downregulating the expression of GSK-3 and up-regulating the expressions of β-catenin and CRMP2.
Keywords: total saponin of Trillium tschonoskii Maxim.; cerebral ischemia; oligodendrocytes; oligodendrocyte precursor cells; GSK-3/β-catenin/CRMP2 signaling pathway
缺血性卒中具有致残率高的特点[1-2]。脑缺血缺氧后不仅诱导大量神经元死亡,还损伤少突胶质细胞,造成髓鞘脱失、轴突功能障碍,是肢体感觉运动和学习记忆障碍的重要原因[3-4]。促进髓鞘修复和轴突重构对改善脑缺血后神经功能缺损症状具有重要意义[5]。延龄草为百合科延龄草属多年生草本植物延龄草Trillium tschonoskii Maxim.的干燥根及根茎,具有活血、通络、安神功效。临床以单味药或配伍应用治疗眩晕头痛、脑震荡后遗症等疾病[6]。延龄草主要活性成分为延龄草皂苷( total saponin of Trillium tschonoskii Maxim., TSTT),前期研究结果显示,TSTT可减轻脑缺血大鼠轴突髓鞘损伤[7],并通过诱导内源性少突胶质前体细胞增殖分化为少突胶质细胞,启动再髓鞘化过程[8],促进轴突损伤后的修复。其分子机制尚待进一步阐明。
研究发现,糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是TSTT抗炎、抗肿瘤的重要作用靶点[9]。GSK-3是一种丝氨
β-连酸/苏氨酸蛋白激酶,脑缺血发生后,GSK-3作为
β
环蛋白( -catenin)、脑衰蛋白反应调节蛋白-2 (CRMP2)的负性调节蛋白,抑制新生细胞增殖与轴突延伸[10],在新生细胞增殖、分化、成熟过程中产生重要的调控作用[11-12]。在前期研究基础上,本研究分析TSTT影响脑缺血大鼠少突胶质前体细胞增殖及保护成熟少突胶质细胞的作用机制,为进一步明确TSTT抗脑缺血损伤的药理作用提供研究基础。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠65只,8周龄,体质量330~ 360 g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动
物生产许可证号SCXK(京)2021-0011。动物饲养于首都医科大学实验动物中心SPF级实验室,温度18~ 22 ℃,湿度40%~60%,自由摄食饮水。动物使用许可证号SYXK(京)2021-0030。本实验过程符合动物伦理相关规定,并经过首都医科大学实验动物伦理委员会审核批准(AEEI-2019-221)。适应性饲养1周后正式进行实验。
1.2 药物与试剂
延龄草药材购自湖北恩施,由首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskii Maxim.的干燥根及根茎,存放于中医络病研究北京市重点实验室。TSTT由首都医科大学中药药效物质基础研究实验室提供,每克提取物相当
g,经课题组前期测定,重楼皂苷Ⅶ、于原药材16.55重楼皂苷Ⅵ、偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-[Oα-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷Ⅴ含量分别为
43.96、98.83、75.27、4.98、4.57 mg/g[7]。使用时分别称取TSTT 65、33 mg ,用 10 mL蒸馏水溶解,配制成6.5、3.3 mg/mL溶液。金纳多(批号1380817),德国威玛舒培博士药厂。使用时将60 mg金纳多溶于10 mL蒸馏水,配成浓度为6 mg/mL溶液。
蛋白聚糖(NG2)抗体(批号ab50009)、2′,3′-环核苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)抗体(批号ab6319)、CRMP2抗体(批号 ab62478 ),英国 Abcam 公司; β
-catenin抗体(批号1247-1),美国Epitomics公司; GSK-3β
抗体(批号GTX111192),美国GeneTex公司; Goat anti-mouse IgG-FITC抗体(批号1036-02)、goat anti-rabbit IgG-TRITC 抗体(批号 4030-03 ),美国SouthernBiotech公司;RNAprep Pure Tissue Kit动物组织总RNA提取试剂盒(批号cat#DP431)、RNase-Free DNaseⅠ试剂盒(批号
RT411),北京天根生化科技有限公司。
1.3 仪器
涡旋混匀器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司,型号VORTEX-5),pH仪(德国Sartorius 公司,型号PB-21),电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司,型号101-OAB型),磁力加热搅拌器(德国IKA公司,型号C-MAG HS7),实时荧光定量PCR仪(美国 Applied Biosystems 公司,型号 7300Real time PCR System),梯度PCR仪(德国Eppendorf公司,型号 Mastercycler pro),台式离心机(德国Sartorius 公司,型号138727)。2实验方法
2.1造模、分组及给药
参照文献[13]制备永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)致大鼠局灶性脑缺血模型。55只造模大鼠经异氟烷吸入麻醉(5%诱导麻醉,2%维持麻醉)后,仰卧位固定,颈前皮肤消毒,正中切口,钝性分离皮下组织。暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),分离迷走神经,结扎ECA主要动脉分支,并用动脉夹夹闭ICA远心端和CCA近心端。在ECA远心端两处结扎并在结扎点间剪一小口,将已备好的尼龙线栓(直径0.265 mm)插入ECA,移去ICA远心端的动脉夹,将线栓沿ECA推向ICA,向内推入16~18 mm,感到阻力后停止进线,结扎动脉残端,移去CCA动脉夹,缝合皮肤。假手术组10只大鼠麻醉后仅暴露ECA、ICA,不结扎。大鼠完全清醒后进行神经行为学观察,以大鼠不能完全伸展左前爪、不能自行行走、不能向左侧旋转为造模成功。参考文献[14]将造模成功大鼠按随机数字表法分为模型组15只、TSTT 65 mg/kg 组 12 只、TSTT 33 mg/kg组12只和金纳多组(60 mg/kg)12只[15]。于术后第6小时开始各给药组灌胃相应药物,假手术组、模型组予等量生理盐水(10 mL/kg),每日1次,连续15 d。2.2 取材
干预结束后,每组随机选5只大鼠麻醉,生理盐水300 mL快速左心室灌注冲洗,4%多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)心内灌注固定,固定充分后,开颅取脑,切取视交叉后4 mm×15 mm×4 mm组织块,投入固定液,4℃固定1周,常规石蜡包埋,切片机连
μm
续切取4 冠状切片,进行HE染色、LFB染色及免疫荧光染色。各组剩余大鼠麻醉后断头取脑,分离梗死灶周围皮层组织,液氮中贮存,进行组织检测。
2.3 HE染色
石蜡切片二甲苯脱蜡,经逐级乙醇至蒸馏水洗脱,苏木素染色10 min,蒸馏水冲洗;盐酸乙醇分化30 s,蒸馏水浸泡15 min;1%伊红染液浸泡15 min,蒸馏水冲洗,常规脱水,中性树胶封片。光学显微镜下用NIS-Elements Basic Research图像采集系统对染色图像进行观察和采集,获取患侧梗死灶周围皮层3个不重叠视野进行分析,统计每个视野下的神经细胞数量,参照文献[16]计算单位面积视野下神经细胞数量(神经细
胞数量÷视野面积)。
2.4 LFB染色
石蜡切片二甲苯脱蜡,经逐级乙醇至水洗;LFB染液染色,4℃孵育过夜;95%乙醇冲洗后,蒸馏水冲
洗;0.05%碳酸锂分化10 s,蒸馏水立即冲洗终止; 70%乙醇分化,观察着色情况,重复碳酸锂和乙醇分化步骤直至灰白质可明显分辨。常规脱水,中性树胶封片。利用NIS-Elements Basic Research图像采集系统对图像进行采集,获取大鼠健侧及患侧梗死灶周围皮层3个不重叠视野进行分析。利用Image J软件统计每个视野下LFB染色的积分光密度(IOD),计算患侧/健侧相对IOD[17]。
2.5 免疫荧光染色
石蜡切片电热鼓风干燥机60 ℃干燥1h,二甲苯脱蜡,乙醇水化,0.01 mol/L PBS冲洗3次,柠檬酸缓冲液热修复抗原。冷却至室温,PBS洗涤2次,10%羊血清 37 ℃封闭 1h ,加一抗: CNPase (1∶ 300)、GSK-3β β
(1∶ 400); CNPase (1∶ 300)、 -catenin (1∶250);NG2(1∶100)、GSK-3β(1∶400);NG2 (1∶100)、β-catenin(1∶250),4℃孵育
48 h。复温, PBS洗涤5次,避光滴加 goat anti-mouse IgG-FITC (1∶300)、goat anti-rabbit IgG-TRITC(1∶400),37 ℃封闭2 h。0.01 mol/L PBS洗涤6次,DAPI染细胞核,避光冷藏保存。荧光显微镜下观察切片,每张切片在梗死灶周围皮层选取3个固定视野进行观察。激发/发射波长470/490 nm条件下,CNPase、NG2阳性细胞呈绿色荧光,分别统计CNPase和NG2阳性表达的IOD;
条件下,GSK-3β、β-catenin激发/发射波长595/618 nm阳性细胞呈红色荧光,利用 NIS-Elements Basic Research图像采集系统计数每个视野内双标阳性细胞数。
2.6 RT-PCR检测
按试剂盒说明提取大鼠缺血边缘脑组织总RNA,以总RNA为模板反转录合成cDNA,配制反应体系混合液进行PCR。反应条件:95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,共40个循环,52 ℃退火31 s,72 ℃延伸与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层单位面积神经细胞数量显著减少(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组和金纳多组大鼠梗死灶周围皮层单位面积神经细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.01)。见表2。β-actin
30 s。以 2-ΔΔCt
为内参,采用 法计算目的基因相对表达量。引物由日本Takara公司合成,引物序列见表1。统计学方法
采用SPSS Statistics 26.0统计软件进行分析。计量
xˉ±s
资料用 表示,符合正态分布且方差齐用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验,方差不齐采用Tamhane's T2检验,不符合正态分布采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
最终存活大鼠为假手术组10只、模型组10只、TSTT 65 mg/kg组10只、TSTT 33 mg/kg组9只、金纳多组10只。
4.1 延龄草皂苷对模型大鼠脑组织病理变化的影响
假手术组大鼠脑组织神经细胞形态正常、核仁清晰、胞浆丰富、排列整齐;模型组大鼠患侧脑组织出现明显坏死区,神经细胞大量死亡,胞体皱缩,胞核深染固缩,胞膜轮廓不清;与模型组比较, TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组及金纳多组大鼠患侧梗死灶周围皮层神经细胞形态有所改善,排列较为整齐。见图1。4.2延龄草皂苷对模型大鼠神经纤维损伤的影响假手术组大鼠脑组织神经纤维排列致密有序,髓鞘结构清晰完整;模型组大鼠患侧神经纤维大量丢失,纤维排列混乱无序,髓鞘中有大量空泡形成;与模型组比较,TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组及金纳
多组大鼠患侧神经纤维排列较有序,轴突外有致密的髓鞘包裹,髓鞘中空泡较少。见图2。
与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层神经纤维相对IOD显著减少(P<0.01);与模型组比较, TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组及金纳多组大鼠梗死灶周围皮层神经纤维相对IOD显著增加(P< 0.01)。见表3。
4.3 延龄草皂苷对模型大鼠梗死灶周围皮层CNPase、NG2表达的影响NG2为少突胶质前体细胞标志蛋白,CNPase为成熟少突胶质细胞标志蛋白。采用免疫荧光染色检测梗死灶周围皮层CNPase、NG2表达,结果显示,假手术组大鼠皮层CNPase阳性表达明显,几乎不表达NG2;与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层CNPase阳性表达显著降低,NG2阳性表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组GSK-3β、NG2/β-catenin、CNPase/GSK-3β、与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层NG2/
CNPase/ β-catenin
阳性细胞显著增加(P<0.01);与模型组比较,
TSTT 65 mg/kg组、TSTT 33 mg/kg组及金纳多组大鼠NG2/GSK-3β、CNPase/GSK-3β
梗死灶周围皮层 阳性及金纳多组大鼠梗死灶周围皮层CNPase、NG2阳性表达显著升高(P<0.01)。见图3、表4。
细胞显著减少,NG2/β-catenin、CNPase/β-catenin阳性
细胞显著增加(P<0.05,P<0.01)。见图4、图5、表5。
4.4 延龄草皂苷对模型大鼠脑组织GSK-3/β-catenin/
CRMP2基因表达的影响与假手术组比较,模型组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3α mRNA表达显著升高, β -catenin、CRMP2 mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比GSK-3α、较,TSTT 65 mg/kg组大鼠梗死灶周围皮层GSK-3β mRNA表达显著降低, β -catenin、CRMP2 mRNA表达显著升高,TSTT 33 mg/kg组大鼠梗死灶周GSK-3α、GSK-3β围皮层 mRNA表达显著降低,金纳多组CRMP2 mRNA表达显著升高(P<0.01)。见表6。