CJI (Traditional Chinese Medicine)
基于自噬-NLRP3炎症小体-IL-1β信号轴探究热补针法对类风湿关节炎寒证模型家兔滑膜炎症的影响
1,苏成红1,秦昕2,井维尧1,刘莉梅1,刘翠1,杜小正 1, 3,张星华4,陈平4,李向军4,张枫帆 4
刘强
袁博
1.甘肃中医药大学针灸推拿学院,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省第二人民医院,甘肃 兰州 730000;
3.甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州 730000;4.甘肃省中医院,甘肃 兰州 730050摘要:目的 观察热补针法对类风湿关节炎(RA)寒证模型家兔滑膜组织自噬-NOD样受体蛋白3 (NLRP3)炎症小体-白细胞介素(IL) -1β信号轴的影响,探讨热补针法治疗RA滑膜炎症的作用机制。方法 48只新西兰家兔随机分为正常组、模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、雷帕霉素组、热补针法组及平补平泻组,每组8只。以弗氏完全佐剂+卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制RA寒证家兔模型。热补针法组和平补平泻组于“足三里”分别施热补针法及平补平泻针法针刺,留针30 min,1次/d,连续14 d;3-MA组和雷帕霉素组分别耳缘静脉注射3-MA和雷帕霉素溶液,1次/2 d,共7次。免疫组化染色检测膝关节滑膜组织IL-1β表达,免疫荧光染色检测滑膜组织NLRP3表达,透射电镜观察滑膜细胞自噬小体形态,Western blot检测滑膜组织自噬蛋白5 (Atg5)、UNC-51样激酶1(ULK1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin-1蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著升高(P<0.05), Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,3-MA组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著升高(P<0.05),Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.05);热补针法组、平补平泻组和雷帕霉素组家兔膝关节周径显著缩小、皮温显著升高(P<0.05),滑膜组织IL-1β、NLRP3表达显著降低(P<0.05), Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05),且热补针法组作用优于平补平泻组。透射电镜观察显示,正常组家兔滑膜细胞胞浆内自噬小体、溶酶体散在分布;模型组和3-MA组家兔滑膜细胞偶见自噬小体分布;雷帕霉素组和热补针法组家兔滑膜细胞可见吞噬泡及双层膜结构的自噬小体,溶酶体数量增加;平补平泻组家兔滑膜细胞偶见吞噬泡、自噬小体及溶酶体等结构。结论 热补针法能抑制RA寒证模型家兔膝关节滑膜炎症反应,其机制可能与调节自噬-NLRP3炎症小体-IL-1β信号轴有关。关键词:类风湿关节炎;热补针法;滑膜炎症;自噬;NLRP3炎症小体;白细胞介素-1β;兔中图分类号:R245.3 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2023)12-0102-07 DOI:10.19879/j.cnki.1005-5304.202306006 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Effect of Heat-reinforcing Acupuncture on Synovial Inflammatory in Rheumatoid Arthritis Rabbits with Cold Syndrome Based on Autophagy-NLRP3 Inflammasome-IL-1β Signaling Axis LIU Qiang1, SU Chenghong1, QIN Xin2, JING Weiyao1, LIU Limei1, LIU Cui1, DU Xiaozheng1, YUAN Bo3, ZHANG Xinghua4, CHEN Ping4, LI Xiangjun4, ZHANG Fengfan4
1. College of Acupuncture-moxibustion and Tuina, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;
2. The Second People’ s Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 4. Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China基金项目:国家中医药管理局甘肃郑氏针法学术流派传承工作室(2305135901);国家自然科学基金(82060891);甘肃省自然科学基金(21JR7RA568、20JR10RA344)通讯作者:杜小正,E-mail:lz-duxiaozheng@163.com
Abstract: Objective To observe the effects of heat-reinforcing acupuncture in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) rabbits with cold syndrome from the perspective of autophagy-NLRP3 inflammasome-IL-1β signaling axis; To explore the mechanism of heat-reinforcing acupuncture in the treatment of synovial inflammation in RA. Methods Totally 48 New Zealand rabbits were randomly divided into normal group, model group, 3-methyladenine (3-MA) group, rapamycin group, heat-reinforcing acupuncture group, and reinforcing-reducing group, with 8 rats in each group. The rabbit model of RA with cold syndrome was replicated by a combination of Freund’s complete adjuvant, egg albumin induction and hypothermic freezing method. The heat-reinforcing acupuncture group and reinforcing-reducing group were treated with “Zusanli” heat-reinforcing acupuncture and reinforcing-reducing accupuncture respectively, with needle retention for 30 minutes, once a day, and intervention for 14 times; 3-MA and rapamycin were injected intravenously into the ear margin once every other day for 7 times in the 3-MA group and rapamycin group respectively. The IL-1β expression in synovial tissue was detected by immunohistochemistry, and the NLRP3 expression was examined by immunofluorescence, the autophagy of synovial tissue was observed by transmission electron microscopy, Western blot was used to detect Atg5, ULK1, LC3 and Beclin-1 protein expression. Results Compared with the normal group, the circumference of knee joint significantly increased and skin temperature of knee joint significantly decreased in model group (P<0.05), the expression of IL-1β and NLRP3 in synovial tissue significantly increased (P<0.05), the protein expressions of Atg5, ULK1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Beclin-1 significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the circumference of knee joint significantly increased and skin temperature of knee joint significantly decreased in 3-MA group (P<0.05), the expression of IL-1β and NLRP3 in synovial tissue significantly increased (P<0.05), the protein expressions of Atg5, ULK1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, and Beclin-1 significantly decreased (P<0.05); the circumference of knee joint significantly reduced and skin temperature of knee joint significantly increased in the heat-reinforcing acupuncture group, reinforcing-reducing group and rapamycin group (P<0.05), the expression of IL-1β and NLRP3 in synovial tissue significantly decreased (P<0.05), the protein expressions of Atg5, ULK1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and Beclin-1 significantly increased (P<0.05), and the action of heat-reinforcing acupuncture group was better than that of the reinforcing-reducing group. Transmission electron microscopy observation showed that autophagosomes and lysosomes were scattered in the cytoplasm in synovial cells of normal group was regular; the distribution of autophagosomes was occasionally observed in synovial cells of rabbits in the model group and 3-MA group; phagocytic vesicles and autophagosomes with double-layer membrane structure could be seen in the synovial cells of rabbits in the rapamycin group and the heat-reinforcing acupuncture group, and the number of lysosomes increased; occasional structures such as phagocytic vesicles, autophagosomes, and lysosomes were observed in synovial cells of rabbits in the reinforcing-reducing group. Conclusion Heat-reinforcing acupuncture can effectively reduce knee swelling and inflammatory infiltration in RA with cold syndrome model rabbits. The possible mechanism is related to the regulation of autophagy-NLRP3 inflammasome-IL-1β signaling axis.
Keywords: rheumatoid arthritis; heat-reinforcing acupuncture; synovial inflammation; autophagy; NLRP3 inflammasome; IL-1β; rabbits
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关
节滑膜炎症、血管翳形成及软骨破坏为主要表现的自身免疫性疾病[1]。免疫细胞浸润促进滑膜血管内皮细胞增殖、迁移及破骨细胞分化,是血管翳形成、软骨破坏的基础[2-3]。自噬是真核细胞通过降解错误折叠蛋白、
功能异常细胞器及病原微生物为细胞提供能量的方式。研究表明,针灸通过提高RA滑膜组织UNC-51样激酶1(ULK1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin-1
等自噬关键蛋白表达增强自噬活性,抑制炎症因子肿
瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)合成与分泌[4-5]。
NLRP3炎症小体由胱天蛋白酶( Caspase-1)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)及凋亡相关斑点样蛋白(ASC)组成。RA滑膜细胞中,线粒体活性氧(ROS)过度产生使线粒体膜通透性增加,线粒体DNA易位到IL-1β释细胞质,导致NLRP3依赖性Caspase-1活化与
放[6]。课题组前期研究发现,热补针法可增强滑膜细胞
自噬活性,降低滑膜组织NLRP3、Caspase-1 mRNA
炎症小体-IL-1β表达[7-8]。本研究基于自噬-NLRP3 信号轴进一步探讨热补针法治疗RA的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级2~3月龄健康新西兰家兔48只,雌雄各半,体质量(2.0±0.5)kg,陕西君行生物科技有限公司提供,动物生产许可证号SCXK(陕)2017-001。饲养于解放军联勤保障部队九四〇医院动物饲养科,温度20~25 ℃、湿度30%~60%环境,自由摄食饮水。本研究经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会审批(2021-040)。
1.2 主要试剂与仪器
弗氏完全佐剂、卵蛋白干粉(美国Sigma公司,货号A5253-250G、F58881),雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA,大连美仑生物,货号J0304A、D1202A), IL-1β、NLRP3、ULK1
一抗(英国Abcam公司,货号分别为 ab202105、Ab263899、Ab177472), Atg5 一抗、GAPDH一抗、HRP标记山羊抗兔IgG (美国Immunoway ,货号分别为 Ab109490、 60004-1-Ig、RS0002), LC3一抗(美国Genetex,货号 14600-1AP),Beclin-1一抗(美国CST,货号Ab207162)。华成牌一次性毫针(苏州东邦医疗器械有限公司, 0.18 mm×13 mm),动物红外线测温枪(思怡佳,型号KM520),高速冷冻离心机(美国BECKMAN,型号Microfuge22R),普通光学显微镜(日本Olympus公司,型号Ⅸ 51),电镜切片机(德国LEICA,型号EMUCK),透射电镜(日本日立,型号JEM1400), Western blot转膜仪、电泳仪及凝胶成像仪(北京君意东方,型号JY-ZY5、JY-SCZ2+、JY04S-3E)。
1.3 分组及造模
随机抽取8只家兔作为正常组,其余40只为造模组,采用弗氏完全佐剂+卵蛋白干粉注射联合低温冷冻法制备RA寒证家兔模型。在家兔后背均匀选定6个注射部位(脊椎正中线与两肩胛骨下角连线“十”字区域),碘伏消毒后,各部位皮下注射诱导液(弗氏完全佐剂50 mL+卵蛋白干粉200 mg+生理盐水50 mL) 0.2 mL,14 d后等量重复注射1次,6d后双后肢膝关节腔内注入诱导液0.4 mL,次日将240 g冰块+80 g结晶氯化钙制成的冰袋围置于家兔后肢双膝关节四周, 30 min后去掉冰袋,45 ℃温水复温5 min,每日2次,连续14 d。以造模后家兔出现膝关节肿胀为模型制备成功[9-10]。
40只家兔均造模成功,按膝关节周径将家兔随机分为模型组、3-MA组、雷帕霉素组、热补针法组和平补平泻组,每组8只。
1.4 干预
成模后次日开始干预,3-MA组及雷帕霉素组分别耳缘静脉注射5 mg/mL 3-MA溶液( 1.9 mg/kg )和25 mg/mL雷帕霉素溶液(2.5 mg/kg),1次/2 d,共7次[11-12];热补针法组选取“足三里”[13],定位参照《实验针灸学》[14],操作参照《郑氏针灸全集》[15],将家兔固定,左手紧按穴位,加重指压,右手将毫针垂直刺入8~12 mm,右手拇指向前连续捻按3次,针尖顶着针感部位连续重插轻提5次,拇指再向前连续捻按3次,针尖顶着有感应部位守气,留针30 min,1次/d,连续14 d;平补平泻组取穴及定位同热补针法组,操作
参照《刺法灸法学》[16],操作者左手拇指紧按穴位,
右手将毫针垂直刺入“足三里”,深度8~12 mm,实施均匀提插、捻转手法,留针30 min,1次/d,连续14 d。正常组和模型组仅抓取固定,不进行干预。
1.5 膝关节周径、皮温检测
造模及干预结束后,用无弹性软皮尺沿家兔股骨内外侧髁旋转一周测量膝关节周径,并以KM 520型动物红外线测温枪测量家兔髌韧带“十”字交叉点位置(距皮肤2 cm)关节温度。
1.6 取材
3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉缓慢注射麻醉处死家兔,仰卧位固定双后腿膝关节,沿髌骨上缘2~3 cm切割并掀开髌骨,纵行分离胫腓骨,眼科剪分离周围关节囊结构,眼科钝性分离器剥离滑膜组织,一侧滑膜组织于4%多聚甲醛中固定,用于透射电镜观察,另一侧滑膜组织置于-80 ℃冰箱保存,用于免疫组化、免疫荧光及Western blot检测。
1.7 免疫组化染色滑膜组织乙醇脱水,浸蜡包埋,切片,脱蜡,修
IL-1β
复封闭后,加入 一抗(1∶100),4℃孵育过夜,复温20 min,PBS冲洗2 min×3次,按1∶100滴加山羊抗兔IgG,常温孵育30 min,PBS冲洗2 min×3次,按1∶100加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,孵育30 min,PBS冲洗2 min×3次,DAB显色,苏木素染核,脱水,中性树脂封片。光学显微镜下观察并采集图像,阳性表达呈棕褐色,Image Pro Plus 6.0软件测量阳性表达的平均光密度,以正常组平均值为基准,
IL-1β
计算各组 相对表达量。
1.8 免疫荧光染色
滑膜组织石蜡切片脱蜡,蒸馏水冲洗后,PBS浸
泡5 min,柠檬酸钠热修复2次,每次5 min,PBS冲洗5 min×3次,3%过氧化氢封闭15 min,滴加5%Triton X-100透化15 min,滴加山羊血清封片,室温孵育15 min,滴加NLRP3一抗(1∶200),4℃孵育过夜,复温35 min,滴加荧光素标记山羊抗兔IgG,室温孵育60 min,DAPI室温染核5 min,滴加山羊血清室温孵育15 min,抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下观察,每张切片随机挑选3个视野拍照,Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性表达的积分光密度(IOD)及组织像素面积(area),计算平均荧光强度(IOD/area),结果以正常组均值进行校正。
1.9 透射电镜观察
取约1 mm3滑膜组织,于2.5%戊二醛中固定, 0.1 mol/L磷酸漂洗3次,每次15 min,1%锇酸固定2 h,磷酸漂洗3次,每次15 min。梯度乙醇脱水20 min, 90%乙醇及90%丙酮脱水15 min,以上操作于4 ℃环境进行。包埋液+纯丙酮混合液(2∶1)室温3h,包埋液+纯丙酮(1∶2)室温过夜,40 ℃烤箱10 h、60 ℃烤箱48 h固化,切片70 nm,3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜下观察,高清数码相机记录图像。
1.10 Western blot检测
取100 mg滑膜组织,加入RIPA裂解液裂解,吸取上清液,BCA法检测蛋白浓度。加入5×上样缓冲液,98 ℃加热变性5 min,凝胶电泳80 V、60 min浓缩蛋白,120 V分离蛋白。200 mA、100 V转膜90 min, PVDF膜置于5%脱脂奶粉,室温封闭1h,加入Atg5、ULK1、LC3、Beclin-1、GAPDH一抗(均为1∶1 000), 4℃孵育过夜,37 ℃孵育30 min,TBST洗膜3次,加入山羊抗兔二抗(1∶4 000),室温孵育90 min。洗膜, ECL曝光,成像系统显影,Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白灰度值,以目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值比值表示蛋白相对表达量。
1.11 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料符合
xˉ±s
正态分布以 表示,方差齐采用方差分析,组间比较用LSD法,方差不齐用Tamhanes T2法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 热补针法对模型家兔膝关节周径、皮温的影响
与正常组比较,模型组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05);与模型组比较,3-MA组家兔膝关节周径显著增加、皮温显著降低(P<0.05),雷
帕霉素组、热补针法组和平补平泻组家兔膝关节周径显著缩小、皮温显著升高(P<0.05);与平补平泻组比较,热补针法组膝关节周径显著缩小、皮温显著升高
(P<0.05)。见表1。各组家兔膝关节周径、皮温比较(xˉ±s)
表1
只数膝关节周径/cm膝关节皮温/℃组别正常组模型组3-MA组雷帕霉素组热补针法组平补平泻组6 6 6 6 6 6 12.16±0.66 16.17±0.78# 17.55±0.81* 12.78±0.97* 12.95±0.49*△ 14.51±0.95* 38.65±0.39 36.57±0.39# 35.75±0.45* 38.16±0.42* 38.22±0.31*△ 37.40±0.25*注:与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05;与平补平泻组比较,△P<0.05
2.2 热补针法对模型家兔膝关节滑膜组织白细胞介素-1β表达的影响与正常组比较,模型组家兔膝关节滑膜组织阳性染色范围增大、染色加深,IL-1β表达显著升高(P< 0.05);与模型组比较,3-MA组家兔膝关节滑膜组织阳性染色范围进一步增大、染色最深,IL-1β表达显著升
高(P<0.05),雷帕霉素组、热补针法组和平补平泻组家兔膝关节滑膜组织阳性染色范围缩小、染色变浅,
IL-1β表达显著降低(P<0.05);与平补平泻组比较, IL-1β热补针法组家兔膝关节滑膜组织 表达显著降低(P<0.05)。见图1、表2。
NLRP3表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,3-MA组家兔膝关节滑膜组织NLRP3表达显著升高(P< 0.05),雷帕霉素组和热补针法组家兔膝关节滑膜组织NLRP3表达显著降低(P<0.05);与平补平泻组比较,热补针法组NLRP3表达显著降低(P<0.05)。见图2、表3。
NLRP3
DAPI
Merge
吞噬泡内含细胞器,自噬小体包裹内质网及延长的线粒体,溶酶体数量增加,胞浆及囊泡自噬代谢物增多;平补平泻组偶见吞噬泡、自噬小体及溶酶体等结构。见图3。
LC3Ⅰ、Beclin-1
蛋白表达进一步下降,热补针法或雷帕霉素干预后,Atg5、ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达较模型组均显著升高,说明热补针法可提高RA模型家兔自噬蛋白表达,增强滑膜组织自噬活性。
热补针法是郑魁山教授融会贯通“捻针补泻法”和“三五助补助泻法”,将繁复的分层操作简化为适用于肌肉浅表部位的“热补针法”,是“取热”针刺手法
的典型代表[27]。该针法既能温补阳气之不足,又能驱
散痹阻之风寒、温通凝聚之血脉,对阳虚风寒湿阻型RA临床疗效确切。平补平泻针法首见于《神应经》,杨继洲将其演化为“小补小泻”;《扁鹊神应针灸玉龙经》首载“平刺”法,将其归纳为虚则导其正气复归、实则导其邪气外泄的导气同精法[28]。阳虚寒凝是RA核心病机,宜用“补”法以“温阳”,用“泻”法以“散寒”。因此,无论先补后泻的“小补小泻”,还是导气出入的“不补不泻”(平补平泻),皆契合RA病机。研究表明,平补平泻针法可有效抑制RA患者关节液核因子(NF)-κB NF-κBp65
通路 蛋白表达,抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6
分泌[29];动物实验也发现,热补针法能减轻RA兔膝关节肿胀、改善炎性细胞浸润,其
作用优于平补平泻组及捻转补法组[30]。本研究以平补
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Clin
(收稿日期:2023-06-01) (修回日期:2023-07-09;编辑:郑宏)