Journal of Prevention and Treatment for Stomatological Diseases
活性氧响应的纳米颗粒对炎性环境下牙龈成纤维细胞功能的影响及机制
邱心一， 宋璐彤， 任双双， 苗雷英南京（210008）南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院牙体牙髓病科，江苏gingivalis⁃lipopolysaccharide，P.g⁃LPS）诱导的牙【摘要】 目的 探讨在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas
龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）炎症环境下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）响应型纳米PssL⁃NAC HGFs ROS、炎症因子、胶原蛋白生成、细胞迁移功能以及Toll 4（Toll⁃like receptor 4，
颗粒 对 内 样受体
TLR4）⁃核因子 κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）通路蛋白表达的影响。方法
本研究已通过单位伦理委员会审ROS的硫缩酮键（thioketal，TK）连接聚己内酯（polycaprolactone，PCL）的疏水端和聚乙二醇
查批准。通过响应
（polyethylene glycol，PEG）的亲水端，水相油相自主装的方式得到内部包裹油溶性的抗氧化剂N⁃乙酰半胱氨酸（N⁃acetylcysteine⁃NAC）的 PssL⁃NAC NAC
微球，制备 水溶液，并使用透射电镜观察验证纳米粒子合成成功。HGFs P.g⁃LPS（0、5、10 μg/mL），P.g⁃LPS（0、5、10 μg/mL）+NAC，P.g⁃LPS（0、5、10 μg/mL）+
在提取的 中分别加入
PssL⁃NAC，共聚焦显微镜观察不同组别细胞内ROS P.g⁃LPS HGFs
水平，确定后续实验使用的 浓度。将 随机分为空白对照组（对照组，不做处理），P.g⁃LPS组（P.g⁃LPS 处理细胞），NAC 组（P.g⁃LPS+NAC PssL
处理细胞）， ⁃NAC 组（P.g⁃LPS+PssL⁃NAC PssL⁃NAC 2',
处理细胞）。通过细胞增殖与毒性实验验证 的生物安全性。使用7'⁃二氯荧光黄双乙酸盐探针与细胞共孵育通过荧光实时定量检测细胞内炎症因子白细胞介素6（inter⁃ leukin⁃6 ，IL⁃6）、肿 α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃ α）和Ⅰ型胶原蛋白（collagen 1，COL1）、Ⅲ
瘤坏死因子 型胶原蛋白（collagen 3，COL3）的基因水平；通过划痕实验观察PssL⁃NAC
对牙龈成纤维细胞的迁移功能的影响；通TLR4⁃NFκB PssL⁃NAC HGFs
过免疫印迹法检测 信号通路相关蛋白的表达。结果 具有良好生物相容性，对 的细胞增殖能力无显著影响（P＞0.05）；在P.g⁃LPS浓度升高的条件下，PssL⁃NAC
能维持细胞内大约两倍对照组ROS 平（P＜0.001）；PssL⁃NAC ⁃LPS IL⁃6（P＜0.001）、TNF ⁃ α
的 水 能显著降低P.g 诱导升高的 基因水平（ P＜ 0.001），上 COL1 P＜0.001）；P.g⁃LPS PssL⁃NAC
调 基因水平（ 刺激后， 能将细胞迁移能力恢复至对照组水平（P＞0.05），并降低TLR4⁃NF⁃κB TLR4（P＜0.001）、p65（P = 0.006）、p⁃p65（P = 0.017）蛋白的表达。结论
通路中
PssL⁃NAC ROS，通过TLR4⁃NF⁃κB P.g⁃LPS
维持细胞内适宜浓度 通路减轻 诱导的细胞炎症，并恢复炎症条件下的细胞胶原生成和细胞迁移功能。
【关键词】 牙龈成纤维细胞； 活性氧； 牙龈卟啉单胞菌； 脂多糖； 炎症； 细胞迁移；
纳米颗粒； 胶原
R78 A 2096⁃1456（2024）04⁃0257⁃09
【中图分类号】 【文献标志码】 【文章编号】
微信公众号
邱心一, 宋璐彤, 任双双, .
【引用著录格式】 等 活性氧响应的纳米颗粒对炎性环境下牙龈成纤维细胞功能的影响及机制[J]. 口腔疾病防治, 2024, 32(4): 257⁃265. doi:10.12016/j.issn.2096⁃1456.2024.04.003.
Effect and mechanism of reactive oxygen species⁃responsive nanoparticles on the regulation of human gingival QIU Xinyi, SONG Lutong, REN Shuangsh⁃ fibroblast function and inflammation induced by lipopolysaccharide uang, MIAO Leiying. Department of Cariology and Endodontics, Nanjing Stomatological Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, Nanjing 210008, China
Corresponding author: MIAO Leiying, Email: miaoleiying80@163.com, Tel: 86⁃25⁃83620211
To investigate the effects of PssL⁃NAC reactive oxygen species (ROS)⁃responsive nanoparti⁃
【Abstract】 Objective
cles on intracellular ROS production, inflammatory factor levels, collagen production, cell function and Toll⁃like recep⁃ tor 4 (TLR4), NF⁃ κB nuclear factor⁃ κB (p65) pathway protein expression in human gingival fibroblasts (HGFs) in⁃ duced by gingivalis⁃lipopolysaccharide (P.g⁃LPS). This study was reviewed and approved by
Porphyromonas Methods
the ethics committee. PssL⁃NAC microspheres containing oil soluble antioxidant N⁃acetylcysteine (NAC) were obtained by connecting the hydrophobic end of polycaprolactone (PCL) and the hydrophilic end of polyethylene glycol (PEG) via thioketal (TK) bonds in response to ROS, and self loading in the aqueous and oil phases. After preparation of the PssL⁃ NAC microspheres and aqueous NAC solution, successful synthesis of the nanoparticles was verified by transmission electron microscopy. Then, HGFs were exposed to P.g⁃LPS (0, 5, or 10 μg/mL), P.g⁃LPS (0, 5, or 10 μg/mL)+NAC, and
P. g⁃LPS (0, 5, or 10 μg/mL)+PssL⁃NAC, and the ROS levels in the different groups were observed under confocal micros⁃ copy to determine the concentration of P.g⁃LPS for use in subsequent experiments. The groups were as follows: control group (no treatment), P.g⁃LPS group (HGFs treated with P.g⁃LPS), NAC group (HGFs treated with P.g⁃LPS and NAC), and PssL⁃NAC group (HGFs treated with P.g⁃LPS and PssL⁃NAC). Cell counting kit⁃8 (CCK⁃8) assays verified the bio⁃ safety of PssL⁃NAC. The ROS levels in the different groups were detected by DCFH⁃DA probes and observed via confo⁃ cal microscopy. Real⁃time qPCR (RT⁃qPCR) was used to monitor the gene expression levels of the intracellular inflam⁃ matory cytokines interleukin⁃6 (IL⁃6), tumor necrosis factor⁃α (TNF⁃α), collagen 1 (COL1) and collagen 3 (COL3). The effect of PssL⁃NAC on the migration of HGFs was observed via the scratch test. The protein expression of TLR4⁃NF⁃κB, and phosphorylated p65 (p⁃p65) in the TLR4⁃NF⁃κB pathway was evaluated by Western blot. PssL⁃NAC had
Results no significant effect on HGF proliferation (P＞0.05). At elevated P.g⁃LPS concentrations, PssL⁃NAC maintained intra⁃ cellular ROS levels approximately twice those in the control group (P＜0.001). PssL⁃NAC significantly decreased P.g⁃ LPS ⁃ induced IL ⁃ 6 (P＜0.001) and TNF ⁃ α (P＜0.001) gene expression and increased COL1 gene expression (P＜ 0.001). After ⁃ LPS stimulation, PssL ⁃ NAC restored cell migration to the control level (P 0.05) and decreased
P.g ＞ the protein expression of TLR4 (P＜0.001), p65 (P = 0.006), and p⁃p65 (P = 0.017) in the TLR4⁃NF⁃κB pathway. PssL⁃NAC maintains the appropriate intracellular ROS concentration, alleviates P.g⁃LPS⁃induced inflam⁃
Conclusion
mation in HGFs through the TLR4⁃NF⁃κB pathway, and restores the cell functions of collagen production and migration in an inflammatory environment. human gingival fibroblasts; reactive oxygen species; gingivalis; lipopolysaccha⁃
【Key words】 Porphyromonas
ride; inflammation; cell migration; nanoparticles; collagen
J Prev Treat Stomatol Dis, 2024, 32(4): 257⁃265.
The authors declare no competing interests.
【Competing interests】
This study was supported by the grants from National Natural Science Foundation of China under Grant (No. 82371015); the Provincial Natural Science Foundation of Jiangsu under Grant (No. BK20221177).慢性牙周炎是一种由细菌引起的慢性炎症性
疾病，是导致牙齿松动脱落的主要原因［1］。研究表明，牙周组织局部的氧化应激环境是导致牙周炎
症加重、组织破坏的主要原因［2］。调节局部活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平从而减轻牙周组织炎症、促进组织再生成为治疗牙周炎的新策
ROS
略［3］，因此，以
为靶点的生物纳米材料研发得
到研究人员高度关注［4］。
PssL⁃NAC（PEG⁃ss⁃PCL@NAC
）是一种能响应
ROS
细胞内高水平 并按需释放药物的纳米释药颗
ROS
粒。针对牙周炎症过程中局部环境中 升高，
ROS的硫缩酮键（thioketal，TK）连接聚己
通过响应
内酯（polycaprolactone，PCL）的疏水端和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的亲水端，水相油相自主N⁃乙酰装的方式得到内部包裹油溶性的抗氧化剂N⁃acetylcysteine⁃NAC）的 PssL⁃NAC半胱氨酸（ 微ROS球。其中，硫缩酮键具有 响应特性，在炎症环ROS高水平下，硫缩酮键断裂，PssL⁃NAC境 微球从NAC疏水蜷缩态转变为舒展态，微球内的 随之释
NAC
放，实现 在炎症部位的靶向积累。本课题组
PssL⁃NAC
前期研究已经成功自主合成、表征 纳米
PssL⁃NAC ROS，通过自
颗粒，证明 能够响应高水平激活调节的方式释放包裹在内部的抗氧化剂
NAC，通过缓释效果将细胞内ROS
维持在适宜的
水平［5］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下
human periodontal ligament
维持人牙周膜干细胞（
stem cells，hPDLSCs）内两倍对照组水平的ROS，并
促进其成骨分化［5］。此外，PssL⁃NAC
能够通过调
mitogen ⁃ activated protein
节丝裂原活化蛋白激酶（
kinase ，MAPK κB（nuclear factor ⁃ κB
）和核因子
p65 ，NF⁃ κB）通路关键蛋白的磷酸化从而调节巨噬M2
表型极化［6］。前期的体内实验中
细胞向抗炎的
PssL⁃NAC
发现 处理后大鼠牙龈纤维较牙周炎大鼠
PssL⁃NAC
排列更加整齐、致密，然而 在细胞水平上对牙龈成纤维细胞的影响和其具体机制仍不清human gingival fibroblasts，
激人牙龈成纤维细胞（ HGFs）模拟炎症反应，观察PssL⁃NAC
在抑制炎症、维持细胞功能中的具体作用及机制，为治疗牙周炎治疗过程中促进软组织再生的策略提供理论依据。1
材料和方法
本研究经南京大学医学院附属口腔医院医学
伦理委员会审查批准（批号：NJSH⁃2022NL⁃009）。2022 10 2023 7
本研究于 年 月至 年 月在南京大学医学院附属口腔医院中心实验室进行。
1.1
主要试剂和仪器
DMEM（11965118，Gibco PBS（G4202，
，美国），
赛维尔，中国），胎牛血清（FSS500，依科赛，中国）， NAC（616⁃91⁃1，Sigma，美国），P.g⁃LPS（SMB00610， Sigma，美国），CCK8试剂盒（CK04，同仁，日本），活S0033S
性氧检测试剂盒（ ，碧云天，中国），细胞
RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT⁃qPCR
试剂盒
（RC112，R323，Q711，诺维赞，中国），RIPA
裂解液
（P0013B，碧云天，中国），DEPC水（B501005，生工， TLR4（ab13556，Abcam，美国），一
中国），一抗抗体
p65、p⁃p65，Tublin（AF5006，AF2006，AF7021，
抗抗体
Affinity，中国）；二抗山羊抗兔抗体（ Ab_2337913， Jackson SurePAGE ™
，美国）； 预制胶，电泳缓冲液
（M42012C，M00138，金斯瑞，中国），TBST（C006161， PVDF 膜（IPVH00010 ，Millipore
生工，中国）， ，美国）。
Nikon Ti A1，Nikon
共聚焦显微镜（ ，日本），
Nanodrop核酸蛋白检测仪（One，Thermo，美国），酶仪（SpectraMAXM3，Thermo，美国）， RT⁃qPCR
标 仪
（ViiA V7Dx，Thermo
，美国），化学发光成像仪
（Tanon5200，天能，中国）。
1.2
人牙龈成纤维细胞的分离、培养
3
选取 例知情同意、既往健康无牙周疾病患者20%拔除阻生齿时需切除的牙龈组织，放入含 胎
牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%双抗（青霉素+ DMEM培养基中，1 h
链霉素）的 内取出牙龈组织，生理盐水反复冲洗，在超净工作台内将牙龈组织
1 mm3 T25
修剪为 的组织块，放入 培养瓶中，加入
5 mL 10% FBS、1% DMEM
含 双抗的 培养基，在
37 ℃、5% CO2培养箱中倒置培养，4 h
后翻瓶。待
80%
细胞在瓶中融合至 后传代，后续实验使用的
3 ~ 6
细胞为 代。
1.3 PssL⁃NAC NAC
微球制备和 水溶液制备
PEG⁃ss⁃PCL（PssL）纳米颗粒溶于 50 mL
将 去
离子水（deionized water，ddH2O）中 5 mg NAC
，将 溶
5 mL
于 二氯甲烷中，使用水相油相自组装的方法，
NAC在超声震荡下，用滴管吸取溶有 的二氯甲烷
PssL 30 mL ddH2O溶液，缓慢滴加到溶有 的 中，迅
45 min。将获得的分散于水中的速搅拌，超声震荡
PssL⁃NAC 1 h，用滴管将该溶液滴加至铜溶液超声
20 nm
网上（附有 厚度的碳支持网），静置干燥后采
JEM⁃100
用 透射电镜观察纳米粒子的形貌及粒径。
5 mg NAC 30 mL ddH2O
将 溶于 中，超声下搅拌混匀
NAC
得到 溶液。
1.4 ROS
细胞内 检测
HGFs 35 mm
将 铺于直径为 玻璃底小皿中，铺1×105个/孔。待细胞融合至80%后分别加板密度为
μg/mL），P.g⁃LPS（0、5、10 μg/mL）+入
NAC，P.g ⁃ LPS（0、5、10 μg/mL）+ PssL⁃NAC。共培24 h 1：1 000 2',7'⁃二养 后，去除原培养基，按 加入
dichlorofluorescein diacetate，氯荧光黄双乙酸盐（
DCFH⁃DA）活性氧探针，在37 ℃、5% CO2
培养箱中
20 min
孵育 ，去除培养基，磷酸缓冲生理盐水
（phosphate buffer saline，PBS）冲 3
洗 次，共聚焦显
488 nm
微镜观察 下的细胞荧光强度，确定后续实验使用的 浓度。
1.5
实验分组将提取的人牙龈成纤维细胞随机分为空白对处理细胞为 组，
NAC
处理细胞为
NAC PssL⁃NAC NAC NAC处理细胞为 组。 组中，将
10%（v/v）加入孔板中，使NAC
水溶液按 终浓度为
20 μg/mL。PssL⁃NAC PssL⁃NAC
组中 的使用浓度为
10%（v/v），在该体积比下，PssL⁃NAC NAC
中 含量与
20 μg/mL NAC
同体积比的 中 含量一致。
1.6
细胞增殖实验
HGFs 96 4×103个/孔。将 铺于 孔板中，铺板密度为
10 μg/mL待细胞贴壁后分别加入 外，
NAC、PssL⁃NAC，共培养1、3、5、7 d分别加入 后，去
10% CCK⁃8除培养基，每孔加入含 试剂盒工作液
DMEM 37 ℃、5% CO2
的无血清 培养基，在 培养箱中
1.5 h，酶标仪450 nm OD
孵育 波长下检测 值。
1.7 RT⁃qPCR
检测炎症因子及胶原生成的相关基因表达
HGFs 6 4×105个/孔。将 铺于 孔板中，铺板密度为
80%后加入NAC PssL⁃NAC待细胞融合至 或 预处理
12 h P.g⁃LPS（10 μg/mL）刺后去除原培养基，加入
6 h，PBS 3 Trizol
激 冲洗 次，加入 裂解液提取细胞
RNA，Nanodrop RNA
总 核酸蛋白检测仪检测 浓度，
cDNA。以GAPDH使用逆转录试剂盒转录为 为内
RT⁃qPCR
参，使用 试剂盒检测炎症因子白细胞介
6（interleukin⁃6，IL⁃6 ⁃α（tumor素 ）、肿瘤坏死因子
necrosis factor⁃α，TNF⁃α）和Ⅰ型胶原蛋白（collagen 1，COL1）、Ⅲ 白（collagen 3，COL3）水平。型胶原蛋
1。
引物序列表见表1 RT⁃qPCR
表 引物序列
Table 1 Primer sequences in RT⁃qPCR
Genes Forward primers Reverse primers
IL⁃6 TTGGGAAGGTTACATCAGATC GGGTTGGTCCATGTCAATTT
TNF⁃α CGTGGAGCTGGCCGAGGAG AGGAAGGAGAAGAGGCTGAGGAAC COL1 GAGGGCCAAGACGAAGACATC CAGATCACGTCATCGCACAAC
COL3 GGAGCTGGCTACTTCTCGC GGGAACATCCTCCTTCAACAG
GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
IL⁃6: interleukin⁃6; TNF⁃α: tumor necrosis factor⁃α; COL1: collagen 1; COL3: collagen 3
1.8
划痕实验观察各组人牙龈成纤维细胞的迁移能力
HGFs 6 4×105个/孔。将 铺于 孔板中，铺板密度为
80%后加入NAC PssL⁃NAC待细胞融合至 和 预处理
12 h μg/mL），用后去除原培养基，加入
0、3、6、12 h
移液枪在孔板底部划痕，划痕后 后拍摄照片，并半定量分析划痕距离变化。1.9 Western blot TLR4⁃NFκB
测定 通路相关蛋白
表达
HGFs 6 4×105个/孔。将 铺于 孔板中，铺板密度为
80%后NAC PssL⁃NAC 12 h待细胞融合至 和 预处理
P.g⁃LPS（10 μg/mL）共后去除原培养基，随后加入
30 min，去除原培养基，PBS 3 RI⁃培养 冲洗 次，加入
PA裂解液和磷酸酶抑制剂提取细胞总蛋白，Nano⁃ drop 1×SDS核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度。加入
95 ℃充分变性。在电泳凝胶均匀加入等上样液后
量蛋白（40 μg），电泳完成后转移蛋白至PVDF
膜，
5% 1 h。将 TLR4、p65、p⁃p65、内参脱脂奶粉封闭
Tublin 1∶1 000
一抗抗体以 比例稀释后均匀覆盖于
PVDF 2 h 3 1∶5 000膜上，室温下孵育 后洗膜 次。将
PVDF稀释的山羊抗兔二抗抗体于 膜室温下孵育
1 h，曝光观察蛋白表达情况。
1.10
统计学分析
SPSS 22.0
应用 软件进行统计学分析，正态分
±
布的计量资料以均数 标准差表示。采用单因素
one ⁃ way ANOVA
方差分析（ ）和双因素方差分析
（two⁃way ANOVA）对各指标进行比较。P＜0.05
为差异有统计学意义。2 2.1
结果
HGFs
细胞原代提取及培养
经组织块培养法培养后，组织块周围可见细
1a）。体外培养的HGFs
胞爬出（图 细胞为长梭形
1b）。
或星形，细胞形态均一（图
2.2 PssL⁃NAC
纳米颗粒成功合成
PssL⁃NAC
采用水相油相自主装合成的 纳米颗
120 nm
粒，电镜下观察形态规则呈球形，直径约为
2）。
（图
2.3 PssL⁃NAC
维持
ROS
内适宜浓度
HGFs刺激下的 细胞μg/mL）相比，随着
Figure 1 Isolation and culture man gingival fibroblasts
图1
人牙龈成纤维细胞的分离与培养of hu⁃
a & b: the morphology is spherical and the diameter is about 120 nm. Scale bar: a: 0.2 μm; b: 100 nm Figure 2 TEM images of PssL⁃ NAC nanoparticles
2 PssL⁃NAC
图 纳米微球透射电镜图
⁃LPS IL⁃6降低了 P.g 诱导的细胞炎症因子
0.001）和TNF⁃α（P＜0.001）的升高。相比于对照组⁃LPS 组，PssL⁃NAC COL1
和 组 基因表达升高
NAC COL1
组细胞 的基因
= 0.022
表达较对照组下降（ ）。与其他三组相
比，PssL⁃NAC COL3
组 基因表达升高，但差异无统
5）。
PssL⁃NAC
在炎症环境下促进细胞迁移
处理后细胞迁移能力2.6 3、6、12h
在 后显著下降（
0.001）。与 组相比，PssL⁃NAC
组在
3、6、12 h
刺激 后能够显著促进炎症状态下的细胞12 h 后，PssL⁃NAC NAC刺激 组细胞融合程度较 组= 0.005），细胞融合程度与对照组无显著= 0.542）（图6）。g⁃LPS; P.g⁃LPS+PssL⁃NAC.
P.g⁃LPS
P.g⁃LPS vs.
P＜0.05; vs. P＜0.05 human gingival
P＜0.05; vs. P.g
(Day 7), P＜0.05; vs. P.g⁃LPS
Figure 4 Cell proliferation ability blasts in different treatment groups图4
不同处理组人牙龈成纤维细胞的增殖活性of
P. fibro⁃ 2.7 PssL⁃NAC TLR4⁃NF⁃κB
通过 降低细胞炎症反应⁃ LPS p65 =
刺激后 蛋白表达升高（
0.008）。NAC PssL⁃NAC TLR4
和 处理后细胞 蛋白
= 0.008，P＜0.001），
表达较
NAC组相比，PssL⁃NAC TLR4
但与 对 蛋白水平的抑
= 0.008）。NAC p65
处理后细胞 蛋
= 0.034），PssL⁃NAC
白表达较 处
p65
理细胞后，细胞 蛋白表达与 组差异更
NAC
加显著（ ），但与 组无显著性差异
= 0.564）。NAC p⁃p65
处理细胞后，细胞 蛋白表
⁃ LPS
达升高，但与对照组和 组无显著性差异
= 0.096，P = 0.140）。但 PssL⁃NAC p⁃p65
组 蛋白
组、NAC = 0.023，P = 0.016，P＜0.001）（图7）。
Control group: blank control, no treatment; P.g⁃LPS group: 10 μg/mL P.g⁃LPS; NAC group: 10 μg/mL P.g⁃LPS +NAC; PssL⁃NAC group: 10 μg/ mL P.g⁃LPS+PssL⁃NAC. α: vs. control group, P＜0.05; β: vs. P.g⁃ LPS group, P＜0.05; γ: vs. NAC group, P＜0.05. IL⁃6: interleukin⁃6; TNF⁃ α: tumor necrosis factor⁃α; COL1: collagen 1; COL3: collagen 3
Figure 5 mRNA expression of inflammatory factors and collagen of human gingival fibroblasts in different treatment groups图5 mRNA不同处理组人牙龈成纤维细胞相关炎症因子和胶原蛋白的 表达情况