Dé­pis­tage pré­na­tal: la pro­messe de l’ADN cir­cu­lant

La Recherche - - Fondamentaux - PRO­FES­SEUR DE PATHOLOGIE CHI­MIQUE

Den­nis Lo, Ins­ti­tut des sciences de la san­té Li Ka Shing, uni­ver­si­té chi­noise de Hong Kong

Dans le sang de la femme en­ceinte cir­culent des frag­ments d’ADN du foe­tus. Cette dé­cou­verte – l’ADN cir­cu­lant – a ou­vert la voie aux tests pré­na­taux non in­va­sifs qui, par exemple, fa­ci­litent le dé­pis­tage de la tri­so­mie 21. Elle est aus­si ap­pli­cable à des pa­tho­lo­gies comme le can­cer. Den­nis Lo, à l’ori­gine de ces tra­vaux, ra­conte son aven­ture scien­ti­fique.

Lors­qu’une femme est en­ceinte, elle sou­haite na­tu­rel­le­ment connaître la san­té du foe­tus qu’elle porte. Un fac­teur dé­ter­mi­nant du bien-être du foe­tus est son gé­nome, co­dé dans l’ADN et por­té par ses chro­mo­somes. Mais com­ment ob­te­nir l’ADN du foe­tus alors qu’il est dans le ventre de sa mère ? Pen­dant long­temps, l’ob­ten­tion de cette in­for­ma­tion gé­né­tique né­ces­si­tait un pré­lè­ve­ment in­va­sif de cel­lules foe­tales. Une am­nio­cen­tèse, par exemple, per­met d’ob­te­nir, à l’aide d’une longue ai­guille, quelques mil­li­litres du li­quide en­tou­rant le foe­tus. Mal­heu­reu­se­ment, cette tech­nique com­porte des risques pour le foe­tus et peut en­traî­ner une fausse couche. Par consé­quent, de­puis des dé­cen­nies, des scien­ti­fiques du monde en­tier tra­vaillent sur des mé­thodes al­ter­na­tives non invasives, no­tam­ment à l’aide d’une simple prise de sang ma­ter­nel. C’est cette quête que je vais vous ra­con­ter, des pre­mières dé­tec­tions de cel­lules foe­tales jus­qu’aux tech­niques les plus ré­centes grâce aux­quelles on par­vient à re­pé­rer des ma­la­dies du foe­tus dans le sang ma­ter­nel. Lorsque j’étais étu­diant en mé­de­cine à l’uni­ver­si­té bri­tan­nique d’Ox­ford, à la fin des an­nées 1980, j’ai com­men­cé à tra­vailler sur des tech­niques pour dé­tec­ter de telles cel­lules foe­tales en cir­cu­la­tion. J’ai pour­sui­vi dans cette voie jus­qu’à la fin de l’an­née 1996 à Ox­ford. Mal­heu­reu­se­ment, les­dites cel­lules sont très peu nom­breuses dans le sang ma­ter­nel. Per­sonne n’a réus­si à dé­ve­lop­per des tests pré­na­taux non in­va­sifs, pra­tiques et fiables, les uti­li­sant. 1997 est l’an­née de la ré­tro­ces­sion de Hong Kong à la Chine, et j’ai pen­sé avec ma femme

que c’était le bon mo­ment de re­tour­ner à la mai­son, ce qui nous don­ne­rait plus de temps pour nous oc­cu­per de nos pa­rents vieillis­sants. Je sa­vais très bien qu’une fois à Hong Kong, je de­vrais mettre au point une nou­velle stra­té­gie de re­cherche. Fa i t i n t é r e s s a n t , t r o i s m o i s avant que je quitte Ox­ford pour Hong Kong, je suis tom­bé sur deux ar­ticles co­écrits, dans Na­ture Me­di­cine, par Phi­lippe An­ker et Mau­rice Stroun, de l’uni­ver­si­té de Ge­nève, où ils dé­mon­traient la pré­sence d’ADN tu­mo­ral sans cel­lule dans le sang de per­sonnes at­teintes d’un can­cer. La par­tie « sans cel­lule » des ré­sul­tats était la plus im­por­tante. Notre sang se com­pose des cel­lules san­guines – c’est-à-dire de glo­bules rouges, de glo­bules blancs et de pla­quettes –, qui sont bai­gnées dans un li­quide ap­pe­lé plas­ma. D’une ma­nière c o n ve n t i o n n e l l e, l o r s q u e l e s scien­ti­fiques ef­fec­tuent des tests d’ADN, ils se concentrent sur les glo­bules blancs, qui contiennent de l’ADN dans leur noyau. La re­cherche d’ADN dans le plas­ma pa­raît contre-in­tui­tive, car une telle re­cherche im­plique que l’ADN flotte hors des cel­lules. Après avoir lu les deux ar­ticles, je pen­sais que le scé­na­rio d’une tu­meur gros­sis­sant chez un pa­tient at­teint d’un can­cer avait des si­mi­li­tudes avec ce­lui d’un foe­tus gran­dis­sant dans l’uté­rus de sa mère. Est-ce qu’un foe­tus li­bère de l’ADN, hors de toute cel­lule, dans le sang de sa mère en­ceinte ? Pour le sa­voir, j’ai dé­ci­dé d’étu­dier le plas­ma ma­ter­nel en fin de gros­sesse, en me di­sant qu’à cette pé­riode, la pro­ba­bi­li­té se­rait plus éle­vée d’y trou­ver de l’ADN foe­tal sans cel­lule. Co mme n t e x t ra i re l’ A D N d u plas­ma de femmes en­ceintes ? Comme je pas­sais d’Ox­ford à Hong Kong à cette époque, j’ai dé­ci­dé d’uti­li­ser quelque chose de très simple : faire chauf­fer le plas­ma à 99 °C pen­dant 5 mi­nutes. C’est un peu comme faire cuire des nouilles chi­noises ins­tan­ta­nées ! Une re­cette que j’ai par­fois réa­li­sée dans ma chambre d’étu­diant lorsque j’en avais as­sez de la nour­ri­ture pro­po­sée au res­tau­rant uni­ver­si­taire. Pour prou­ver que le si­gnal ADN que j’ob­ser­vais était ce­lui du foe­tus et non ce­lui de la mère, j’avais dé­ci­dé d’uti­li­ser une sé­quence seule­ment pré­sente sur le chro­mo­some Y, un chro­mo­some mas­cu­lin. C’est ain­si que j’ai dé­tec­té un si­gnal de chro­mo­some Y dans cer­tains échan­tillons de plas­ma bouillis pro­ve­nant de femmes en­ceintes. Ces si­gnaux n’étaient pré­sents que chez les femmes en­ceintes por­teuses de foe­tus mas­cu­lins. Ces don­nées ont consti­tué la pre­mière preuve qu’il exis­tait ef­fec­ti­ve­ment de l’ADN foe­tal libre cir­cu­lant dans le plas­ma ma­ter­nel (1).

Nou­velle tech­no­lo­gie

Pour éva­luer la concen­tra­tion de cet ADN foe­tal cir­cu­lant et com­ment ce­la chan­ge­rait au cours de la gros­sesse, j’ai eu la chance d’uti­li­ser une nou­velle tech­no­lo­gie qui de­ve­nait alors dis­po­nible. Cette mé­thode bap­ti­sée ré­ac­tion en chaîne par po­ly­mé­rase en temps réel (PCR) est une mé­thode d’am­pli­fi­ca­tion de l’ADN, qui crée ain­si un si­gnal plus im­por­tant que l’on peut dé­tec­ter plus fa­ci­le­ment. À l’aide de cette ma­chine, j’ai mon­tré que 3 à 10 % de l’ADN to­tal dans le plas­ma san­guin d’une femme en­ceinte pro­ve­naient du foe­tus. De telles concen­tra­tions étaient éton­nam­ment éle­vées, compte te­nu de la grande dif­fé­rence de taille entre un foe­tus et sa mère. J’ai éga­le­ment étu­dié la va­ria­tion de la concen­tra­tion d’ADN foe­tal cir­cu­lant à me­sure que la gros­sesse pro­gresse. Toutes ces in­for­ma­tions étaient es­sen­tielles pour dé­ter­mi­ner à quel stade de la ges­ta­tion l’uti­li­sa­tion d’ADN foe­tal libre cir­cu­lant pou­vait don­ner des ré­sul­tats fiables pour des tests pré­na­taux non in­va­sifs. J’étais éga­le­ment cu­rieux de sa­voir ce qui ar­ri­vait à l’ADN foe­tal cir­cu­lant après la nais­sance. Ce­ci est im­por­tant car des tra­vaux dé­mon­traient qu’un pe­tit nombre de cel­lules foe­tales pou­vaient per­sis­ter dans le corps d’une femme même après son ac­cou­che­ment. Je vou­lais sa­voir si une telle per­sis­tance se­rait éga­le­ment vraie pour l’ADN foe­tal sans cel­lule. J’ai donc ef­fec­tué une étude où j’ai pré­le­vé des échan­tillons de sang de femmes en­ceintes juste avant la cé­sa­rienne, puis deux heures après. Fait in­té­res­sant, j’ai consta­té que cet ADN foe­tal était éli­mi­né ex­trê­me­ment ra­pi­de­ment après l’ac­cou­che­ment. En ef­fet, la plu­part des femmes n’avaient plus d’ADN foe­tal dé­tec­table dans leur plas­ma deux heures après l’ac­cou­che­ment. Cette don­née dé­montre que l’ADN foe­tal exempt de cel­lules ne per­siste pas dans le plas­ma ma­ter­nel et n’af­fec­te­rait pas les ré­sul­tats des tests pré­na­taux non in­va­sifs ef­fec­tués lors d’une deuxième gros­sesse. Avec ces in­for­ma­tions de base, j’étais alors prêt à uti­li­ser l’ADN foe­tal cir­cu­lant pour réa­li­ser des tests pré­na­taux. La pre­mière sé­rie d’ap­pli­ca­tions consis­tait à dé­tec­ter des sé­quences d’ADN foe­tales hé­ri­tées du père et évi­dem­ment ab­sentes du gé­nome de

Le plas­ma d’une femme en­ceinte a été chauf­fé à 99 °C pen­dant 5 mi­nutes pour y ex­traire l’ADN

la mère. Un exemple est la dé­tec­tion des sé­quences chro­mo­so­miques Y qu’un foe­tus mas­cu­lin a hé­ri­té de son père. La dé­tec­tion de telles sé­quences per­met de dé­ter­mi­ner le sexe du foe­tus, ap­pli­ca­tion utile pour le dé­pis­tage pré­na­tal de ma­la­dies liées au sexe, telles que l’hé­mo­phi­lie et cer­taines formes de dys­tro­phie mus­cu­laire. Les gènes im­pli­qués dans ces pa­tho­lo­gies sont pré­sents sur le chro­mo­some X. En gé­né­ral, chez les foe­tus fé­mi­nins, qui ont deux co­pies du chro­mo­some X, l’ano­ma­lie du gène si­tué sur l’un des chro­mo­somes X est com­pen­sée par l’autre chro­mo­some X sain. Ce n’est pas le cas du foe­tus mas­cu­lin, qui n’a qu’un chro­mo­some X et est donc plus sus­cep­tible de pré­sen­ter de tels troubles. Un autre exemple est la dé­tec­tion d’une mu­ta­tion qu’un foe­tus a hé­ri­tée de son père. Ce­pen­dant, la rai­son la plus cou­rante pour la­quelle une femme en­ceinte op­te­rait pour un test pré­na­tal est le dé­pis­tage des ano­ma­lies chro­mo­so­miques foe­tales, comme le syn­drome de Down. Ce­lui-ci est le plus sou­vent cau­sé par un foe­tus ayant une co­pie sup­plé­men­taire du chro­mo­some 21, c’est pour­quoi on l’ap­pelle tri­so­mie 21. Dé­tec­ter le syn­drome de Down en uti­li­sant l’ADN cir­cu­lant est plus dif­fi­cile que de dé­ter­mi­ner le sexe du foe­tus ou s’il a hé­ri­té d’une mu­ta­tion de son père. C’est parce que ces der­nières ap­pli­ca­tions sont des ana­lyses qua­li­ta­tives, cor­res­pon­dant à une ré­ponse « oui » ou « non » pour sa­voir si le foe­tus a hé­ri­té d’un chro­mo­some Y ou d’une mu­ta­tion par­ti­cu­lière. En outre, pour re­pé­rer la tri­so­mie 21, il faut me­su­rer avec pré­ci­sion com­bien de co­pies du chro­mo­some 21 pos­sède le foe­tus. Ce­la est par­ti­cu­liè­re­ment dif­fi­cile lorsque la mère en­ceinte pos­sède éga­le­ment son propre chro­mo­some 21, qui li­bère aus­si des sé­quences d’ADN dans son propre plas­ma. Par consé­quent, dans le plas­ma d’une femme en­ceinte, il existe un mé­lange de mo­lé­cules d’ADN li­bé­rées par le chro­mo­some 21 du foe­tus, et le chro­mo­some 21 de la mère. Plus dif­fi­cile en­core, les sé­quences du chro­mo­some 21 du foe­tus sont la com­po­sante mi­no­ri­taire du plas­ma ma­ter­nel. Sur une pé­riode de dix ans, j’ai dé­ve­lop­pé un cer­tain nombre de mé­thodes dif­fé­rentes pour at­teindre cet ob­jec­tif.

Dé­jà dis­po­nible

Fi­na­le­ment, en 2007, nous avons mon­tré qu’en comp­tant une par une les mo­lé­cules d’ADN cir­cu­lant, on pou­vait dé­tec­ter une lé­gère aug­men­ta­tion des mo­lé­cules d’ADN du chro­mo­some 21 chez une femme en­ceinte por­tant un foe­tus avec le syn­drome de Down (2). En 2008, nous avons pu­blié un rap­port mon­trant que l’uti­li­sa­tion d’une

L’ADN foe­tal cir­cu­lant ne per­siste pas dans le plas­ma ma­ter­nel après l’ac­cou­che­ment

mé­thode par la­quelle un mil­lion de mo­lé­cules d’ADN sé­quen­cées au ha­sard dans le plas­ma ma­ter­nel pou­vait dé­ce­ler, chez le foe­tus, la tri­so­mie 21 avec une sen­si­bi­li­té et une spé­ci­fi­ci­té très éle­vées. Nous avons ter­mi­né le pre­mier es­sai cli­nique à grande échelle de cette mé­thode en 2011. À ce jour, ce test pré­na­tal non in­va­sif (TPNI) est dis­po­nible dans plusieurs pays à tra­vers le monde, et des mil­lions de femmes en­ceintes sont tes­tées chaque an­née. Par exemple, 4 mil­lions de ces tests ont été réa­li­sés en Chine en 2017. À la suite de ce­la, le nombre de tests pré­na­taux in­va­sifs clas­siques a consi­dé­ra­ble­ment di­mi­nué dans de nom­breux pays. D’autres ano­ma­lies chro­mo­so­miques peuvent être si­gna­lées à l’aide d’un TPNI, comme celles qui im­pliquent le chro­mo­some 18, le chro­mo­some 13 et les chro­mo­somes sexuels. Des groupes de re­cherche ont éga­le­ment mon­tré que l’ap­proche peut être ap­pli­quée pour dé­tec­ter des ano­ma­lies im­pli­quant seule­ment une sous-ré­gion d’un chro­mo­some. Il est im­por­tant de gar­der à l’es­prit que, lors­qu’il est uti­li­sé pour dé­tec­ter des ano­ma­lies chro­mo­so­miques, le TPNI est uti­li­sé comme un dé­pis­tage (bien que très pré­cis) plu­tôt que comme un test de diag­nos­tic. Par consé­quent, à la suite d’un ré­sul­tat anor­mal du TPNI, une étape de confir­ma­tion im­pli­quant un test in­va­sif, comme l’am­nio­cen­tèse, est né­ces­saire. En ef­fet, le TPNI est sus­cep­tible d’en­gen­drer des ré­sul­tats faus­se­ment po­si­tifs. Ce­la peut se pro­duire pour une rai­son sta­tis­tique. Des la­bo­ra­toires peuvent dé­fi­nir comme re­père, pour dé­ter­mi­ner que le ré­sul­tat est anor­mal, un seuil plus éle­vé que ce­lui d’une femme en­ceinte por­tant un foe­tus nor­mal. On peut éga­le­ment ob­te­nir un faux po­si­tif pour une rai­son bio­lo­gique : l’ADN foe­tal pré­sent dans le plas­ma ma­ter­nel est li­bé­ré par le pla­cen­ta. Or, dans cer­tains cas, il est pos­sible que le pla­cen­ta contienne une po­pu­la­tion de cel­lules avec une ano­ma­lie chro­mo­so­mique, alors que les cel­lules du corps du foe­tus sont par­fai­te­ment nor­males. Par ailleurs, il est pos­sible qu’un TPNI donne un ré­sul­tat faus­se­ment né­ga­tif, no­tam­ment si le foe­tus est por­teur d’une ano­ma­lie chro­mo­so­mique qui n’est pas ob­ser­vée dans le test. L’une des rai­sons du faux né­ga­tif est qu’un échan­tillon de plas­ma ma­ter­nel peut conte­nir un ni­veau d’ADN foe­tal trop faible pour que le test d’ADN fonc­tionne de fa­çon ro­buste. C’est la rai­son pour la­quelle cer­tains four­nis­seurs de TPNI éva­luent d’abord la concen­tra­tion d’ADN foe­tal dans un échan­tillon de plas­ma ma­ter­nel avant de com­mu­ni­quer un ré­sul­tat. Il peut éga­le­ment y avoir une rai­son bio­lo­gique : le pla­cen­ta ne contient que des cel­lules nor­males, tan­dis que le corps du foe­tus porte une ano­ma­lie chro­mo­so­mique. En plus de ces tra­vaux, nous avons éla­bo­ré des tech­no­lo­gies pour la réa­li­sa­tion de TPNI des­ti­nés aux troubles gé­né­tiques uniques

À la suite d’un ré­sul­tat anor­mal, la confir­ma­tion avec une am­nio­cen­tèse est né­ces­saire

(ma­la­die mo­no­gé­nique), comme la bê­ta-tha­las­sé­mie – une forme hé­ré­di­taire d’ané­mie com­mune dans la ré­gion mé­di­ter­ra­néenne et des par­ties de l’Asie du Sud-Est –, l’hy­per­pla­sie sur­ré­nale congé­ni­tale – un trouble en­do­cri­nien hé­ré­di­taire –, etc. Nous avons dé­ve­lop­pé une tech­nique qui me­sure la dose re­la­tive d’un gène mu­tant par rap­port à un gène nor­mal. Nous avons aus­si mis au point une autre tech­no­lo­gie pour faire la me­sure du do­sage re­la­tif de mar­queurs gé­né­tiques qui se trouvent à proxi­mi­té du gène. Une telle sé­rie de mar­queurs gé­né­tiques consti­tue un « ha­plo­type » et, par consé­quent, cette der­nière tech­nique est éga­le­ment ap­pe­lée mé­thode de do­sage re­la­tif des ha­plo­types (RHDO). La mé­thode RHDO semble être très ro­buste, en rai­son de l’ef­fet sy­ner­gique confé­ré par des mar­queurs gé­né­tiques mul­tiples.

Une tech­nique coû­teuse

Afin d’ex­plo­rer la « li­mite » du TPNI, j’ai cher­ché à voir si l’on pou­vait sé­quen­cer tout le gé­nome foe­tal du plas­ma ma­ter­nel. Je n’avais tout d’abord au­cune idée de la meilleure fa­çon de faire ce­la. Ce­pen­dant, un jour, je suis al­lé voir le film Har­ry Pot­ter et le Prince de sang mê­lé avec ma femme. La pre­mière par­tie de ce film était en 3D. Je me sou­viens avoir vu le titre du film vo­ler vers moi. Mes yeux ont été cap­tu­rés par les deux traits ver­ti­caux dans le « H » du mot « Har­ry ». Je me suis sou­dain ren­du compte que la fa­çon de dé­chif­frer le gé­nome foe­tal pré­sent dans le plas­ma ma­ter­nel se­rait de di­vi­ser la tâche en deux moi­tiés. Une pre­mière par­tie consiste à dé­duire, à par­tir de l’ADN pa­ter­nel, ce qu’il a pu hé­ri­ter de son père, et la se­conde à dé­duire, à par­tir de l’ADN ma­ter­nel, ce qui a été trans­mis par sa mère. Grâce à des sé­quen­ceurs puis­sants, nous avons scru­té pas moins de 4 mil­liards de mo­lé­cules d’ADN pré­sentes dans le sang d’une femme en­ceinte, dans le but d’iden­ti­fier celles ap­par­te­nant au foe­tus. En com­pa­rant les échan­tillons pa­ter­nels et ma­ter­nels en 900 000 points, le gé­nome foe­tal a été re­cons­ti­tué en 2010 (3). Cette ap­proche a en­suite été confir­mée par un cer­tain nombre d’autres groupes. La mise au point de ces tests a en­gen­dré des ques­tions éthiques, so­ciales et ju­ri­diques. Par exemple, en Chine conti­nen­tale, il existe des lois strictes contre la dé­ter­mi­na­tion pré­na­tale du sexe de l’en­fant à ve­nir pour des rai­sons non mé­di­cales. Mal­heu­reu­se­ment, un cer­tain nombre d’en­tre­prises se sont ins­tal­lées à Hong Kong en rai­son de son sta­tut de ré­gion ad­mi­nis­tra­tive spé­ciale de la Chine. Elles y trans­fèrent ain­si illé­ga­le­ment des échan­tillons de sang ma­ter­nel hors de Chine afin de réa­li­ser desTPNI pour connaître le sexe de l’en­fant. Une ré­gle­men­ta­tion plus ri­gou­reuse se­rait né­ces­saire pour sup­pri­mer ces ac­ti­vi­tés. Le sé­quen­çage du gé­nome com­plet du foe­tus pré­na­tal non in­va­sif a ou­vert de nou­veaux dé­bats sur l’im­pact po­ten­tiel d’une telle tech­nique. À l’heure ac­tuelle, elle est en­core trop coû­teuse pour être mise en oeuvre dans la pra­tique cli­nique. Ce­pen­dant, avec la ré­duc­tion conti­nue des coûts de sé­quen­çage de l’ADN, il est pro­bable qu’ils ne consti­tue­ront plus un obs­tacle ma­jeur. Par ailleurs, il existe des pré­oc­cu­pa­tions per­sis­tantes quant à l’iden­ti­fi­ca­tion de mu­ta­tions d’ADN non ré­per­to­riées et la dif­fi­cul­té d’in­ter­pré­ter leur si­gni­fi­ca­tion cli­nique… Es­pé­rons qu’avec nos pro­grès conti­nus dans la com­pré­hen­sion des fonc­tions du gé­nome hu­main, notre ca­pa­ci­té à in­ter­pré­ter les ré­sul­tats gé­no­miques s’amé­lio­re­ra pro­gres­si­ve­ment.

Ce tube à es­sai contient du sang (au fond) et du plas­ma (au-des­sus). La re­cherche d’ADN dans le plas­ma était contre-in­tui­tive, car elle im­plique que l’ADN flotte hors des cel­lules.

Nombre d’am­nio­cen­tèses, un test in­va­sif, pour­raient être évi­tées grâce à une mé­thode consis­tant à re­pé­rer et ana­ly­ser l’ADN foe­tal dans le sang ma­ter­nel.

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