Bioimpresiones, sistemas CAD/CAM, ITOP y regeneración celular. Aplicaciones en odontología
Bio-impressions, CAD/CAM systems, ITOP and cellular regeneration. Dentistry applications
Mediante este trabajo se pretende dar a conocer una nueva línea de investigación en los campos de la odontología, biología celular y prótesis dental. El objetivo primordial es ofrecer una base sobre los diferentes sistemas que a su fin acaban por definir esta nueva tecnología de regeneración tisular (en este caso enfocada al dentario), proclive a su mejora e investigación. Se pretende dar a conocer las siguientes bases: conceptos básicos de biología celular en el ámbito de las células madre referentes a los tejidos buco-dentales, una pequeña mención sobre la conocida tecnología CAD/CAM e información sobre la tecnología ITOP y sus resultados. Este “review” bibliográfico centra su mayor atención en el sistema ITOP, desarrollado por el grupo de científicos de Anthony Atala, director del Wake Forest Institute for Regenerative Medicine- Medical Center Boulevard-Winston-Salem, NC. EE.UU. Se obtienen unos resultados satisfactorios de regeneración y creación de un nuevo diente en casi toda su estructura con éxito de implantación en ratas. Una base sobre la que se puede apostar por una nueva investigación que mejore los resultados expuestos, pudiéndose crear dientes en humanos en toda su integridad con éxito de implantación.
Introducción
En el presente trabajo, expondremos los avances referidos a la creación de nuevos tejidos con tecnología de impresión 3D con base CAD/CAM y biología celular, en referencia a la regeneración y creación de nuevas piezas y material dentario. Existe una necesidad clínica de regeneración de los tejidos orofaciales perdidos y restauración de la función y la estética. Postnatalmente, algunas células orofaciales progenitoras con propiedades de células madre-progenitoras pluripotentes que se pueden aislar fácilmente y ser utilizadas para la regeneración dentaria. El diente es un órgano principal formado por pulpa biológica viable encerrada en dentina mineralizada que puede estar cubierta con cemento y esmalte en varias especies1. Los dientes de los mamíferos no se regeneran espontáneamente tras un traumatismo o accidente patológico, a diferencia de tiburones y lagartos2,3. La administración celular ha sido el enfoque predominante en la regeneración de los dientes y mejora de los resultados protésicos y odontológicos4,5. En algunos estudios, precursores ontogenéticos y células osteoprogenitoras de médula ósea, fueron inducidos para la de tejidos biológicos similares a dientes, hueso alveolar y ligamento periodental6,7. En otras investigaciones se ha visto como el epitelio oral embrionario y el mesénquima adulto, regulan la ontogénesis por inducción mutua, produciendo estructuras dentales tras el trasplante en el hueso de la mandíbula8. De forma similar, la implantación de precursores molares de rata en maxilares de ratones adultos produjo estructuras dentales con hueso circundante9,10,11. Un reto para la ingeniería de tejidos es producir construcciones celulares vascularizadas tridimensionales (3D) de tamaño, forma e integridad estructural clínicamente relevantes. Sale a la luz un sistema llamado ITOP (Tejido y Órgano Integrado); este sistema consta de tres unidades principales: un controlador de 3 ejes, un módulo de dispensación y una cámara de acrílico cerrada, ambos controlados. El proceso también incluye la ilustración del patrón básico
de arquitectura 3D incluyendo múltiples hidrogeles cargados de células y del polímero PCL de soporte, y un proceso de CAD/CAM para la impresión automatizada de la forma 3D imitando el tejido u órgano diana. Un modelo 3D CAD desarrollado a partir de datos de imágenes médicas genera un programa de movimiento visualizado, que incluye instrucciones para los movimientos de la etapa XYZ y la presión neumática de actuación para lograr la impresión 3D12,13,14,15. Cobrando importancia en la regeneración bucodental16. El sistema ITOP (Tejido y Órgano Integrado) diseñado a medida, consiste en un sofisticado sistema de boquillas con una resolución de 2-50 μm que deposita hidrogeles cargados de células junto con polímeros biodegradables. La matriz celular que consta de gelatina, fibrinógeno, ácido hialurónico y glicerol, se optimiza para promover la supervivencia y diferenciación celular, a la vez que proporciona soporte y dispersión uniforme. La forma mecánica y la resistencia son proporcionadas por polímeros de poli ( γcaprolactona). Y una capa externa de Pluronic F-127. Después de la impresión, la adición de una solución de trombina induce la reticulación del fibrinógeno y eliminación Pluronic F-127 biológicamente incompatible. La estabilidad mecánica se consigue imprimiendo hidrogeles cargados de células junto con polímeros biodegradables en patrones integrados y anclados en hidrogeles sacrificiales. La forma correcta de la construcción de tejido se logra representando datos de imágenes clínicas como un modelo informático del defecto anatómico y traduciendo el modelo en un programa que controla los movimientos de las boquillas de impresora, que dispensan células a lugares discretos. La incorporación de microcanales en las construcciones de tejido facilita la difusión de nutrientes a las células impresas, superando así el límite de difusión de 100-200 mm para la supervivencia celular en tejidos modificados por ingeniería genética. Demostramos las capacidades del ITOP fabricando hueso mandibular, cartíla- go y músculo esquelético. El desarrollo futuro del ITOP está dirigido a la producción de tejidos para aplicaciones humanas y para la construcción de tejidos y órganos sólidos más complejos16,17,18. En el presente trabajo se expondrán algunas de las bases celulares sobre las cuales se investiga y se obtiene una regeneración celular óptima para la reconstrucción bucodental, centrándonos en las células madre pluripotentes. Así mismo, se procurará información base sobre los sistemas CAD/ CAM, tanto en su aplicación en el tema requerido, como en otros temas ejemplo para tener una visión global y local de sus posibilidades y entender mejor su funcionalidad dentro del ITOP mencionado; sobre el que se realizará la explicación pertinente.
Finalmente se expondrá un caso clínico ejemplo sobre la regeneración dentaria y de tejido bucal circundante, donde se englobarán gran parte de los conceptos descritos en los puntos previos, pero en aplicación final a la biología celular dentaria. Siendo este caso clínico, resultado de una de las últimas investigaciones realizadas por la Universidad de Columbia, Estados Unidos, con una potente perspectiva de futuro en este tipo de técnicas y un avance en el campo de la Prótesis Dental.
Bases celulares
Los dientes tienen su origen en dos de las tres capas blastodérmicas primitivas, el ectodermo y el mesodermo, donde desarrolla un importante papel el ectomesénquima, o mesénquima migrado a la mandíbula o maxilar desde las crestas neu- rales19. En los primeros estadios de la odontogénesis se produce una interacción entre las células epiteliales del ectodermo y las células mesenquimales20. La porción ectodérmica dará lugar al esmalte, mientras que las células mesenquimatosas darán lugar a los tejidos mesodérmicos: dentina, pulpa y cemento21. Muchas de las células mesenquimales permanecen indiferenciadas una vez finalizada la odontogénesis, conservando su potencial de diferenciación21,22,23,24. En ingeniería tisular, las células más prometedoras, son las células madres mesenquimales (CMM) adultas. Estas CMM son indiferenciadas con capacidad de autorenovarse, pluripotentes, presentan morfología de fibroblasto y plasticidad hacia diversos linajes celulares como condrocitos, osteocitos y adipocitos entre otros. Estas células pueden ser aisladas principalmente de médula ósea, cordón umbilical y tejido adiposo. Se han hecho proliferar en cultivos in vitro, lo que ha permitido estudiar algunas de sus propiedades funcionales25. En la cavidad oral podemos encontrarlas en la pulpa, en el folículo dental y en el tejido conectivo gingival entre otros26. La pulpa posee células mesenquimáticas indiferenciadas que derivan del ectodermo de la cresta neural, constituyendo una verdadera reserva celular, poseen capacidad de diferenciarse en nuevos odontoblastos o fibroblastos según el estímu-
lo que actúe sobre ellas27. Algunos de los usos de estas células han sido para desarrollar modelos de regeneración de tejido periodontal in vivo28,29. Hay múltiples formas de clasificación de las C.M. en función de diversos criterios30:
Según su origen:
• Origen embrionario: poseen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula (totipotentes), contando así con un enorme potencial para la regeneración tisular.
• Origen adulto: también son denominadas células madre postnatales. Son multipotentes y sobre ellas cabe destacar que su potencial de diferenciación queda restringido a la capa embrionaria de la que procedan. Las MSC (mesenchymal stem cells/células madre estromales) fueron aisladas por primera vez en aspiraciones de médula ósea.
Según el potencial de diferenciación:
• C.M. totipotentes: Son aquellas capaces de originar un embrión y un individuo completo, diferenciándose hacia cualquier estirpe celular. • C.M. pluripotentes: Tienen la capacidad de poder desarrollar los 200 tejidos de un ser humano pero no el tejido extraembrionario. • C.M. multipotentes: Pueden originar un subconjunto de tipos celulares. • C.M. oligopotente: Al igual que las anteriores, pueden desarrollar un conjunto de tipos de células, pero mucho más reducido. • C.M. unipotentes: Con capacidad para diferenciarse en un único tipo celular. Células Madre Dentales (C.M.D.): Son C.M. que poseen potencial de multidiferenciación y, por tanto, pertenecen al grupo de C.M. adultas, teniendo la capacidad de formar células con carácter osteo/odontogénico, adipogénico y neurogénico. Sin embargo, se puede afirmar que, en comparación con las C.M. de la médula ósea, las C.M.D tienen predilección por el desarrollo odontogénico. Existen diversos tipos de células madre de origen dental31: 1. Células madre de la pulpa (Dental Pulp Stem Cells (DPSC)). Fueron las primeras células madre dentarias que se aislaron31. Por analogía con las células madre de la médula, se consideró que había una comunidad de células multipotenciales en el tejido pulpar de dientes maduros. El origen y localización exacta de estas células sigue siendo incierto. La producción de DPSC es muy pequeña (1 por 100 de todas las células) y según aumenta la edad del individuo, la disponibilidad de estas células se ve reducida. Se han estudiado sobre todo las células que provienen de terceros molares y dientes supernumerarios. Cabe destacar que, si son aisladas durante la formación de la corona, las DPSC son más proliferativas que si se aíslan más adelante. De cara a un uso terapéutico
ha de tenerse en cuenta su interacción con biomateriales. Las células madre de la pulpa dental (DPSCs) han demostrado que pueden resolver todas estas cuestiones: el acceso al lugar donde se encuentran estas células es fácil y de escasa morbilidad, su extracción es altamente eficiente, tienen una gran capacidad de diferenciación, y su demostrada interacción con biomateriales las hace ideales para la regeneración tisular. La capacidad de diferenciación de las DPSC quedó demostrada en estudios experimentales en ratas, donde se pudo observar su potencial terapéutico para la reparación de un infarto de miocardio inducido tras ligadura de las arterias coronarias. Con las mismas capacidades prácticamente que las DPSC, se puede hablar de un subtipo: Las SBP-DPSCs son capaces de diferenciarse hacia osteoblastos, sintetizando chips de tejido óseo tridimensionales in vitro que se pueden diferenciar en osteoblastos y en endoteliocitos. Su asombrosa capacidad de diferenciación les permite dar lugar in vivo a hueso adulto con canales de Havers y la apropiada vascularización.
2. Células madre del ligamento periodontal (Periodontal Ligament Stem Cells (PDLSC)). Varios estudios afirman que el ligamento periodontal tiene poblaciones de células que pueden diferenciarse tanto hacia cementoblastos como hacia osteoblastos. La presencia de múltiples ti-
pos de células en el periodonto sugiere que este tejido contiene C.M. llamadas PDLSC (Periodontal Ligament Stem Cells) que mantienen la homeostasis y la regeneración del tejido periodontal. Los análisis in vivo con PDLSC realizados en ratones inmunocomprometidos, sugirieron la participación de estas células en la regeneración de hueso alveolar al propiciar la formación de una fina capa de tejido muy similar al cemento que, además de contar entre sus componentes con fibras colágenas, se asociaron íntimamente al hueso alveolar próximo al periodonto regenerado. Las fibras colágenas generadas in vivo en humanos, fueron capaces de unirse con la nueva estructura formada de cemento, imitando así la unión fisiológica de las fibras de Sharpey. De estos estudios y análisis se podría decir que las PDLSC podrían contener un subgrupo de células capaces de diferenciarse hacia cementoblastos/cementocitos así como hacia células formadoras de colágeno. Se sabe que el gen ADAM28 se expresa en el germen dentario, las células de la papila dental y las células del folículo dental, y se supuso que estaría involucrado en el proceso morfogénico tanto de la corona como de la raíz. El gen ADAM28 actúa en la proliferación, apoptosis y diferenciación de las PDLSCs.
3. Células madre de dientes temporales exfoliados (SHED): Las SHED se consideran una importante fuente de células madre de fácil obtención. Los dientes deciduos y los permanentes tienen importantes diferencias en cuanto a su función, proceso de desarrollo y estructura tisular, y al comparar las SHED con las DPSC, se encontró una mayor velocidad de proliferación y una mayor capacidad de especialización. Aisladas de manera exitosa, se estudia la posibilidad de que jueguen un papel importante en la composición epitelial para la reparación o regeneración del diente, ya que sus características morfológicas se correspondían con el fenotipo de células madre epiteliales, pudiendo llegar a expresar marcadores epiteliales32. Es necesario el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) para que las SHED se diferencien hacia células endoteliales. Los dientes deciduos no sólo favorecerían la guía eruptiva de los dientes permanentes, también pueden estar involucrados en la inducción ósea durante la erupción del permanente.
4. Células madre de la papila dental (Stem Cells from the Apical Papilla (SCAP): La papila apical hace referencia al tejido blando situado en los ápices del diente permanente que se está formando33. Existe una zona muy rica en células entre la papila apical y la pulpa. Parece que las SCAP son las precursoras de los odontoblastos primarios, responsables de la formación de la dentina radicular, mientras que las células madre de la pulpa (DPSC) son, probablemente, las precursoras de los odontoblastos que forman la dentina reparativa. Además, éstas últimas, contienen un mayor componente vascular y celular que las SCAP. Se utilizaron las SCAP para conseguir.
5. Células madre del folículo dental (Dental Follicle Precursor Cells (DFPC)): Son las que acabarán formando el periodonto, constituido por cemento, ligamento, hueso alveolar y encía. In vitro, estas células muestran una morfología típica de fibroblastos. Después de inducción, se
ha demostrado diferenciación osteogénica. In vivo se ha identificado el antígeno STRO-1 en los folículos dentales. El trasplante de estas células genera una estructura constituida de tejido fibroso rígido. No se ha observado ni dentina, ni cemento, ni formación ósea en el trasplante in vivo. Distintos autores han explicado la posibilidad de que sea debido al reducido recuento celular en los cultivos.
CAD/CAM
Se trata de la tecnología implicada en el uso de ordenadores para la realización de trabajos, modificación, análisis y optimización de un diseño. La función principal en estas herramientas es la definición de la geometría del diseño33. El termino CAD se puede definir como el uso de sistemas informáticos en la creación, modificación, análisis u optimización de un producto. El termino CAM se puede definir como el uso de sistemas informáticos para la planificación, gestión y control de las operaciones34. Existen pues unos componentes y fundamentos básicos de un CAD/CAM, así como la estructura base del sistema CAD y las aplicaciones CAD/ CAM que nos permiten obtener un buen uso del sistema en muchos ámbitos34,35,36.
Sistema Itop
Hoy en día, al combinar el escaneo oral, el diseño CAD/CAM y la impresión 3D, los laboratorios dentales pueden producir con precisión y rapidez coronas, puentes, yeso/piedra y una amplia gama de aparatos ortodónticos. Las investigaciones con las impresoras 3D combinadas con CAD/CAM, fueron prosperando hasta que recientemente un equipo de investigadores biomédicos del Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa ha elaborado una bio-impresora 3D con la que se pueden elaborar tejidos humanos relativamente simples, como el cartílago de una oreja humana, a partir de células pluripotentes. Usando cartuchos cargados con plástico biodegradable y células humanas embebidas en un gel, este nuevo tipo de impresora 3D produce trozos complejos de músculo, cartílago, e incluso huesos. Cuando se implantan en animales, estos tejidos fabricados simples sobreviven de forma indefinida. Los científicos, dirigidos por Anthony Atala12, superaron dos retos que han impedido durante mucho tiempo el objetivo de imprimir tejidos humanos vivos: en primer lugar, su nuevo dispositivo supera la barrera de fabricar trozos grandes y estables de tejido impreso que no se caigan a pedazos; en segundo lugar, mantener esas grandes estructuras vivas y en crecimiento. La nueva impresora 3D se dio a conocer en la revista Nature Biotechnology, siendo ésta es la primera bioimpresora que puede imprimir tejido a escalas relevantes para la implantación humana. Una vez impresa una estructura, podemos mantenerla viva durante varias semanas antes de implantarla. Este nuevo dispositivo es llamado Integrated Tissue and Organ Printing System (ITOP). La impresora lentamente imprime capa tras capa de un material de endurecimiento rápido en forma de pequeñas gotas. Al igual que otras impresoras 3D, este enfoque por capas permite al ITOP imprimir formas altamente complejas en tres dimensiones con un detalle increíble. Los materiales que usa el ITOP y las formas en que estructura los tejidos que construye son los que hacen que esta máquina sea revolucionaria. La impresora de Atala12 puede inyectar células madre vivas suspendidas en gel. Esas células pueden ser cualquier cosa, desde el músculo de un ratón, el cartílago de un conejo, a las células madre del líquido amniótico humano filtrado. La clave del éxito de la máquina, sin embargo, es que combina esas células con otro material, un plástico biodegradable llamado policaprolactona. Como un andamio diminuto, este plástico mantiene el tejido impreso alrededor de él en buenas condiciones estructurales, como si lo estuviera fabricando y como si las células en crecimiento se enraizaran. Más tarde, se disuelve y se pierde. Esta no es la primera bioimpresora 3D, pero los dispositivos anteriores han sido bastante limitados, en cuanto al tamaño del tejido vivo que pueden crear. Eso es porque la mayoría de los tejidos vivos necesitan una afluencia de sangre y nutrientes para mantenerse sanos. Pero las impresoras de tejidos en 3D no son lo suficientemente avanzadas como para imprimir características complejas como las arterias y los vasos sanguíneos. De acuerdo con Atala12, hasta hoy, la mayor estructura impresa que ha podido ser mantenida
con vida sin células de sangre fue de sólo 0,007 pulgadas de espesor. Eso es aproximadamente el doble del tamaño de un grano de sal. El ITOP, sin embargo, consigue evitar esta limitación de tamaño, mediante la fabricación de un entramado de valles microscópicos en el hueso, músculo o cartílago que imprime. Con el apoyo de los andamios de plástico biodegradable, estos valles permiten que los nutrientes y la sangre fluya, manteniendo los tejidos vivos durante meses antes de ser implantados. El equipo ha demostrado que el ITOP puede imprimir una impresionante serie de materiales vivos. En sus demostraciones, los científicos hacen a mano los moldes de las orejas de tamaño infantil, cartílagos, trozos de hueso de la mandíbula, fragmentos de huesos del cráneo y tiras de músculo, todos a partir de células madre. Se usan cartuchos múltiples37 para suministrar y modelar múltiples hidrogeles compuestos cargados de células, usando como soporte el polímero de poli ( caprolactona (PCL)) y un hidrogel de Pluronic F-127. El extremo de cada cartucho está conectado a una boquilla de micro escala, y la parte superior está conectada a un controlador de presión de aire para controlar con precisión el volumen de dispensación. Otra unidad se encarga de que el PCL permanezca fácilmente dispensable. Un sistema de etapas motorizado de tres ejes permite el modelado 3D de múltiples células y biomateriales. El sistema reside en un recinto humidificado y controlado por temperatura (18 ° C). La forma correcta de una construcción de tejido se obtiene de un cuerpo humano mediante el procesamiento de datos de tomografía computarizada (TC) o de resonancia magnética (MRI) en el software de diseño asistido por ordenador (CAD). Se genera un programa de movimiento de boquilla personalizado incorporando el patrón de impresión en combinación con condiciones de fabricación ( por ejemplo, velocidad de barrido, temperatura, información de material y presión de aire). El ITOP utiliza un programa de movimiento basado en texto que consiste en una lista de comandos para los movimientos de la etapa XYZ y para el accionamiento de la presión de aire (código fuente suplementario). El programa de movimiento se transfiere entonces al ordenador principal del sistema de impresión 3D que efectúa el proceso de biofabricación. El hidrogel compuesto para la deposición de células consistió en gelatina, fibrinógeno, ácido hialurónico (HA) y glicerol mezclado en DMEM ( glucosa alta). Los polímeros sintéticos confieren resistencia a la estructura. La tecnología ITOP es válida para generar estructuras celulares 2D y 3D. Usando fibroblastos 3T3 ( línea celular preformada precursora de fibroblastos) clasificados con dos tipos de tintes, Dil (rojo) y DiO (verde), se produjo la deposición de estas dos poblaciones en una estructura 2D. Para la creación de estructuras 3D, los fibroblastos 3T3 fueron combinados en hidrogeles con PCL (tipo de poliéster biodegradable), con una posterior impresión de estos en dos estructuras: tipo I y tipo II. Estas dos estructuras difieren en la distribución de PCL y en su resistencia. El tipo I, contiene múltiples entrelazados de PCL en cada capa, para la posterior contención de células y geles en esta estructura. El tipo II, contiene un hidrogel cargado de células y estructuras porosas, rodeado todo ello de PCL que protege esta estructura principal. Siendo así que las estructuras tipo I son mucho más estables que las de ti-
po II, haciendo referencia a la cantidad de PCL en cada una de las estructuras. El tipo I ha sido usado con éxito demostrado en la fabricación de hueso mandibular y cartílago de oreja37,38; mientras que el tipo II ha sido usado para la construcción de músculo esquelético. En el caso presente y debido a la relación directa con el tema, nos centraremos en la demostración de la reconstrucción de hueso mandibular con sus componentes anexos. Estructuras 3D fueron creadas a partir del tipo I y tipo II, formando entrelazados de hidrogel con células y PCL (~130 μm del tipo I y ~250 μm del tipo II). Los microcanales (tipo I: 500 × 300 μm2; tipo II: 650 × 450 μm2), formados por estructuras de PCL, fueron diseñados para facilitar y maximizar la difusión de oxígeno y nutrientes. Además, fue añadido hidrogel de Pluronico F-127 para el soporte de la estructura 3D. Después de el “cross-linking” de fibrinógeno usando trombina, los componentes “uncross-linked” ( gelatina, HA, glicerol and Pluronic F-127) fueron retirados. Para determinar la viabilidad celular durante la impresión, fueron examinados los fibroblastos 3T3 activos, cada 60 minutos (en los días: 0, 3 y 6) después de la impresión. Analizando el número de células vivas/muertas, se mostró que un ≥95% de células tenía viabilidad en el día 0 y así durante 3 y 6 días. La proliferación celular fue testada usando el ensayo “AlamarBlue” ( basado en la detección de la actividad metabólica mitocondrial) y se demostró una proliferación celular activa y creciente durante 15 días, siendo similar a la proliferación celular de los grupos control encapsulados en construcciones de fibrina. Estos resultados indican que la mezcla de hidrogel mantiene la viabilidad celular durante el proceso de impresión y proporciona un ambiente óptimo para la proliferación celular.
Reconstrucción de hueso mandibular:
Para demostrar la construcción de hueso humano, se reprodujo hueso humano mandibular para la suplantación de hueso perdido. La línea celular usada fue la extraída de líquido amniótico con células madre ( hAFSCs), la cual proporciona linajes osteocíticos. Para describir la forma mandibular, fueron usados datos de un escáner CT (Tomografía com- puterizada) en combinación con el software Mimics, para producir el modelo CAD. Mediante programación CAD/CAM, fue determinada la correcta disposición del hidrogel cargado con células, la mezcla de PCL/ TCP (fosfato tricalcico) y Pluronico F127. La mezcla PCL/ TCP y hAFSCs fue añadida al hidrogel con células y imprimida dando lugar a una estructura tipo I con Pluronico F127 como soporte temporal. Al paso de 1 día de cultivo, la viabilidad celular en las estructuras óseas impresas fue de 91 ± 2% (n = 3), lo que confirma que el proceso de impresión no afectó negativamente a la viabilidad celular. Después de la inducción de la diferenciación osteo-genética utilizando un protocolo establecido durante 28 d (n = 5), teñimos las estructuras con Alizarin Red S (Un ensayo comúnmente usado para identificar osteocitos que contienen calcio en un cultivo diferenciado de células madre mesenquimatosas humanas y roedoras). La tinción en la superficie de las estructuras óseas 3D indicó deposición de calcio en el hidrogel cargado de hAFSC. Las construcciones 3D antes de la diferenciación no mostraron tinción con Alizarin Red S.