CASO CLÍNICO

Introducción del caso

La Biología celular ha sido el enfoque predominante en la regeneración de los dientes. Las células disociadas del germen de los dientes de rata o porcino, produjeron precursores de dentina y esmalte4. Brotes de células dentales y células osteoprogenitoras de médula ósea, fueron colocados en colágeno, PLGA o proteína silk actuando como andamio principal, e indujeron tejidos similares a dientes, hueso alveolar y ligamento periodontal7. El epitelio oral embrionario y el mesénquima adulto regulan juntos los genes de la odontogénesis por inducción mutua, produciendo así estructuras dentales y permitiendo el trasplante de hueso mandibular8. Células multipotentes de la papila apical dental de muestras tomadas a partir de incisivos porcinos, colocados en fosfato tricálcico, generan tejidos blandos y mineralizados que se asemejan al ligamento periodontal18. Epitelio oral de ratón E14.5 y mesénquima dental fueron reconstruidos en gel de colágeno y se cultivaron ex vivo y cuan-

do se implantaron en la extracción del molar superior en ratones de 5 semanas de edad se produjo la morfogénesis del diente y seguidamente la erupción. Varios estudios han comenzado a abordar semejante tarea enfocada al diente humano39. La regeneración de los dientes por trasplante de células es un enfoque meritorio. Sin embargo, hay ciertos obstáculos que debemos tener en cuenta. Las células germinales embrionarias xenogénicas (de origen no humano) pueden provocar rechazo inmunitario y dimorfogénesis (desarrollo de estructuras aberrantes) de los dientes. Las células germinales autólogas (del mismo paciente) postnatales ( por ejemplo, los terceros molares) o células madre autólogas de la pulpa dental, son de disponibilidad limitada. Hasta hace poco, el costo excesivo de la comercialización y las dificultades en la aprobación reglamentaria han impedido la regeneración de los dientes. Se fabricó un andamio anatómico con microcanales interconectados (diámetro, 200 \ mu m) como conductos para el hospedar las células endógenas y permitir la angiogénesis. Fue regenerado de nuevo, ligamiento periodontal y hueso alveolar, en este andamio preformado, permitiendo una buena integración con el hueso alveolar nativo a las 9 semanas de implantación in vivo. “Cell homing by stromal-derived factor-1” (SDF1) y el “bone morphogenetic protein 7” (BMP7) son las encargadas de reclutar las células endógenas y permitir la angiogénesis. Estos hallazgos representan la primera demostración de la formación de un diente nuevo y la integración periodontal in vivo, y puede proporcionar un enfoque clínicamente traducible.

Materiales y métodos

Diseñando impresoras 3D para la confección de estructuras “andamio” dentales. La forma anatómica y las dimensiones del incisivo central de una rata se derivaron de múltiples “cortes” del escaneo 2D del incisivo de rata extraído40. Se construyeron andamios con la forma del incisivo central mandibular de la rata41a y el primer molar mandibular humano41b, fabricado vía 3D aposición capa por capa. El compuesto consistió en 80% en peso de policaprolactona (PCL) y 20% en peso de hidroxiapatita (HA). PCL-HA se co-fundió a 120 ° C y se dispensó a través de una boquilla de metal de calibre 27 para crear microtransductos 3D ( grosor de la pared de 200 μm) y una interconexión de microcanales (diam., 200 \ mu m) d.

41c, Enviando señales bioactivas en los microcanales. Todos los andamios se esterilizaron en óxido de etileno durante 24 horas. Se mezcló SDF1 (100 ng / ml) y BMP7 (100 ng / ml) y se colocó en 2 mg / ml de solución de colágeno tipo I neutralizada. Se seleccionó SDF1 debido a sus efectos para unirse a los receptores CXCR4 de múltiples linajes celulares, incluyendo células madre / progenitoras mesenquimales. BMP7 fue seleccionado por sus efectos sobre las células de la pulpa dental, los fibroblastos y los osteoblastos en la elaboración de una mineralización42. Las dosis de SDF1 y BMP7 se escogieron del trabajo in vivo43. Con el colágeno cargado con SDF1 y BMP7, la solución se infundió en los microcanales del andamio por micropipetas (N = 11 para andamios incisivos de rata, N = 11 para humanos Molares), y se produjo el “crosslink” (formación de enlaces moleculares) a 37° C durante 1 h41e,f. Los andamios del grupo control se infundieron con el mismo gel de colágeno, pero sin el factor de crecimiento (N = 11 para andamios incisivos de rata; N = 11 para andamios molares humanos). Regeneración de dientes “in vivo”. A continuación se muestran los resultados visuales de crecimiento e integración celular y tisular mediante los andamios preconstruidos44. Después de la aprobación de IACUC, 22 machos (12 semanas de edad) se dividieron al azar en tratamiento. Se utilizó PMMA ( poli metacrilato de metilo) el cual permite la posterior desmineralización de los andamios y seccionó a 5 μm, para una posterior tinción con hematoxilina y eosina (H& E) y la tinción de von Kossa (VK). Se procedió a la cuantificación de los vasos sanguíneos y células, asi como la estructura general derivada en los andamios de incisivo de rata45j y de los andamios molares humanos46g, analizando posteriormente un estudio T normal de distribución de datos comparándolos con el grupo control y con alfa de 0,05.

Resultados

Regeneración dental sin trasplante celular. El lugar de extracción mandibular del incisivo, representa la diana de regeneración dentaria.

Los “andamios” con forma de incisivo, son integrados en la mandíbula de rata y hay muestras de crecimiento exitoso de los tejidos circundantes al roedor de la estructura y dentro de los canales de la estructura, formándose un nuevo diente a partir de las células45a. En el momento de la extracción del “andamio base”, después del crecimiento exitoso del diente nuevo, fue imposible no efectuar algún daño al tejido circundante, por tanto es preferible que haya una mejora en las técnicas de extracción del andamio base44. Microscópicamente, los andamios mostraron crecimiento de tejidos de diferentes naturalezas, todas propias para la formación de un diente óptimo: Hueso alveolar nativo integrado ( b), hueso de nueva generación (nb) y tejido fibroso precursor del ligamento periodontal ( pdl) 45a. El hueso de nueva generación (nb) creció exitosamente en y entre todos los microcanales del andamio preformado (s) 45a. Este hueso de nueva generación (nb) obtuvo un crecimiento magnificente y de buena estructuración, siendo así que se formaron trabéculas de hueso45b con células incrustadas precursoras de osteocitos maduros. El precursor de ligamento periodontal mostraba también fibroblastos y estructuras de colágeno óptimas ( pdl) 45b. Según la preparación de Von Kossa, el hueso de nueva generación (nb) mostraba una muy buena mineralización45c. Aunque las células poblaron los microcanales en los andamios del grupo control sin factores de crecimiento45c, el crecimiento celular fue significativamente mayor ( p<0.01)45f en los grupos con SDF1 y BMP745e. La angiogénesis tuvo lugar en ambos grupos h,

45g, pero en grupo con SDF1 y BMP7, elaboró muchos más vasos sanguíneos y de mejor estructura que el grupo control ( p<0.05) 45i. Los números de las células y los vasos sanguíneos reclutados se cuantificaron en 3 lugares diferentes a lo largo de toda la longitud de la raíz del incisivo mandibular de rata: la región superior de la cresta alveolar, la región media y la región inferior del ápice de la raíz45j. -Regeneración dentaria ectópica sin trasplante celular-Andamios molares humanos implantados. Microscópicamente hubo un crecimiento celular en los microcanales del andamio, sin factores de crecimiento46a. Cuantitativamente, al combinar SDF1 y BMP746b, este crecimiento celular fue significativamente superior que en el grupo control ( p<0.01) 46c. La angiogénesis se produjo en ambos grupos (Figs. 4A, 4B), pero en el grupo con SDF1 y BMP7, se obtuvieron muchos más vasos sanguíneos y de mejor calidad ( p<0.05) 46d. Según Von Kossa, se mostró una mineralización correcta46e, f. Fueron analizadas diferentes seciones de la raíz del molar humano contenido en el andamio, para cuantificar la angiogénesis y la densidad celular: parte coronal, mediana y axial46g.

Discusión

Este estudio representa el primer ensayo exitoso de la formación de un diente nuevo e in vivo mediante células vivas de nueva generación. El potencial para la creación de dichas estructuras, reside no solamente en la capacidad de albergar estas células en los andamios de microcanales, sino también en la capacidad para la formación de hueso alveolar y ligamento periodontal. La formación de dientes requiere una conjunción y condensación de células de múltiples linajes47. El ligamento periodontal putativo observado y el hueso alveolar recién formado sugieren la capacidad de SDF1 y / o BMP7 para reclutar múltiples linajes celulares. SDF1 es quimio táctico para las células madre / progenitoras de la médula ósea y las células endoteliales, ambas críticas para la angiogénesis48. El SDF1 se une a CXCR4, un receptor de quimioquinas para las células endoteliales y células madre / progenitoras de médula ósea49. SDF1 ha alojado células madre progenitoras endoteliales y mesenquimales, en hueso alveolar nativo, mediante las estructuras de andamio en forma de diente previamente creadas e implantadas en hueso mandibular; mientras que las células progenitoras de tejido conectivo fueron implantadas en tejido dorsal subcutáneo para formar un molar humano (con la base estructural del andamio preformado) 50. BMP7 juega papel importante en la diferenciación osteoblástica y fosforilación vía SMAD, lo que induce la transcripción de múltiples genes osteogénicos y odontogénicos51. Aquí, BMP7 es responsable del hueso alveolar de nueva generación mineralizado en la cavidad de extracción de la rata y la mineralización del diente huma-

no formado de nuevo e implantado en el dorso. Este estudio en curso ha identificado factores adicionales de crecimiento que pueden constituir un conglomerado óptimo para la regeneración de los dientes. El albergue celular es un enfoque poco reconocido en la regeneración de tejidos, y ofrece una alternativa a la regeneración de los dientes. El aislamiento celular y la manipulación ex vivo puede acelerar los procesos clínicos52. El diseño actual del andamio representa una variación de enfoques en la regeneración de dientes confiando principalmente en materiales blandos, incluyendo colágeno, PLGA, etc. La rigidez y resistencia mecánica del híbrido PCL-HA es adecuada para el soporte de cargas53. El “Bioprinting 3D” tiene un control preciso del tamaño de poro, porosidad, rigidez e interconectividad, así como unas buenas dimensiones anatómicas. Los dientes del paciente pueden ser escaneados mediante CT o MR y imprimidos mediante 3D, formando así los andamios estructurales (estos pueden ser personalizados para cada paciente o estándares para un grupo de pacientes). El presente estudio, siendo el primero de su tipo para la formación de tejidos parecidos a los dientes muestra que aún queda un rango muy amplio de investigaciones en este dominio. Las muestras celulares (en condiciones in vivo) fueron mezcladas en PMMA, porque PCL-HA no puede ser descalcificado con parafina. El PMMA no permite inmunotransferencia por parte de ciertos anticuerpos50. El incisivo mandibular fue regenerado básicamente en su raíz y parte sub- oclusal de la corona, careciendo de una regeneración de esmalte o dentina. Se considera una regeneración significa- tiva la radicular y sub- oclusal, pudiéndose añadir secundariamente un esmalte creado en laboratorio protésico. Se obtuvo una regeneración exitosa de ligamento periodontal y hueso alveolar, junto con su integración a los tejidos nativos. Este tipo de regeneraciones tienen como objetivo un avance en clínica y un beneficio para el paciente52.

Debate

Hay que seguir investigando acerca de la idoneidad de los trabajos con células madre en este campo, mejorando los resultados de algunos grupos celulares testando su potencial interés siendo ejemplo de esto los DFPC31. Hay que ser muy cuidadosos en la selección de sistemas CAD/CAM buenos y precisos, dado que éstos pueden comprometer en buena parte la correcta estructuración final del diente preformado a partir de crecimiento celular35,36. Son fuertes los avances de la tecnología ITOP descrita y desarrollada por Anthony Atala, aun así, estos resultados pueden ser mejorados con mayor investigación, para que se pueda lograr la creación completa del diente y su integración en los tejidos bucales humanos, dado que en estos estudios hubo problemas de regeneración completa de esmalte, posiblemente por falta de acuración en alguno de los procedimientos44,45,50.

Conclusiones

Se han obtenido grandes resultados en el campo de la biología celular y los sistemas ITOP de bioimpresión. Es necesario un seguimiento de las investigaciones para conseguir resultados todavía más avanzados y prosperar en las aplicaciones clínicas.