大豆猝死综合症病原菌的土壤分离与分子检测技术应用分析
摘要：大豆猝死综合症是世界大豆主产国发生的新真菌病害，近几年趋于严重，SDS是土传病害，可随大豆贸易传入新的地区。中国是美国大豆进口大国，为保护我国大豆生产，研究确立SDS检测技术，对口岸采集图土样检测。对分子检测技术进行改进，采用PCNB选择性培养基对口岸采集图样稀释培养，在ITS2设立特异引物FVS/A，产生650bp左右的电泳条带，对土样进行分子检测，表明可鉴别SDS病原菌北美种。
关键词：大豆猝死综合症；检测技术；土壤分离
大豆猝死综合症是大豆发生的镰刀菌引起的土传病害，是我国关注列入新修订进境植物检疫危险性病虫杂草名录有害生物。1971年在阿肯色州首次发现，目前广泛分布于巴西等大豆产区，造成巨大经济损失。菜豆根腐病菌在PDA培养基础上，菌落特征与SDS病原菌相似， 2003年Aoki等根据为害地区分子系统发育特征，将SDS病原菌分为南北美种，国外关于SDS病原菌的研究较多，但未涉及与F.phaseoli区分。研究采用分析RFLP图谱可区分SDS病原菌。本实验找到特异引物，将SDS病原菌与其他Fusarium spp区分，优化PCR检测技术，建立适合口岸应用的分子检测技术。
1. 大豆猝死综合症病原菌相关研究
大豆为豆科大豆属，中国种植大豆已有五千多年的历史，其品种丰富，世界上其他国家栽培大豆大多从中国传播。大豆是我国重要油料作物，是主要的牲畜饲料。世界上为害大豆的病虫害有上百种，列入我国检疫性有害生物为害病害有菜豆细菌性萎蔫病菌、烟草环斑病毒等。近年来，一些新兴有害生物引起各国学者的广泛关注。大豆猝死综合症由2种镰刀菌引致，造成损失达100%，病菌可在土壤存活多年。
1982年大豆猝死综合症病原菌定名为Fusarium solani，2003年SDS病菌分为南北美种。大豆猝死综合症危害性大，美国约有13个州发生过SDS，常见损失为5%-15%，我国是大豆生产大国，产量位列世界第四。大豆猝死综合征主要分布于巴西等国，自1971年SDS首次发现后迅速扩展到密苏里、田纳西、依阿华等州。1991年阿根廷在彭巴斯草原首次报道SDS发生，阿根廷的SDS病原菌有南北美种。1992年巴西首次报道SDS，现SDS遍布巴西200多万公顷大豆产区。
SDS在1971年出现时未确定病名， 1982年M.C.Hirrel将其命名为大豆猝死综合征，由于病害进展与品种抗性等有关，敏感品种的未成熟植物会快速死亡，发病叶部组织很快枯死。SDS可表现在幼苗期，环境条件适合植株停止发育。SDS幼苗期症状表现为植株矮小，斑点沿叶脉扩大。SDS叶部症状为叶面出现圆形褪绿色斑点，最终全部枯黄组织坏死。叶片边缘伴随卷曲现象。发病时叶片脱落，可导致花果发育不全，高温天气症状减轻。叶面不表现症状，根部无症状，严重感病植株主根形成蓝色菌落，可作为田间鉴定SDS特征。
大豆猝死综合症危害性大，容易导致植株豆粒小，严重影响大豆产量。近几年在美国发生趋于普遍，低温多雨年份损失达100%。数据表明， SDS成为制约大豆产量的重要因素。我国每年要从国外进口大量大豆，主要出口国为大豆猝死综合征疫区。大量进口国外大豆会增加危害性有害生物入侵中国的风险。国家质检局设立大豆猝死综合征病菌检疫技术研究课题，已列入我国公布禁止进境的危险性病虫杂草名单。
2. SDS土壤分离与分子检测实验
供试菌株来自阿肯色大学植物病理系大豆实验室，大豆疫霉菌由实验室分离保存。检测土样来自沿海口岸大豆船只，主要来自巴西等大豆猝死综合症多发国家。实验仪器包括核算蛋白检测仪、台式冷冻离心机、PTC200型PCR扩增仪。试剂购自华美生物工程公司， MgCl、Taq DNA聚合酶购自Promega公司，引物由上海英俊生物公司合成。
PCNB选择性培养基，参照报告SDS病菌选择性培养基MNSM配方，以其中1/ 5氯硝基苯英文缩写命名为PCNB，配方为15g蛋白胨，0.5g硫酸镁。高压灭菌冷却50℃，加入0.34g新霉素， 0.1g氯四环素。从5株Etucumamiea菌种保存土壤中挑取少量土壤，加入1ml无菌水中，取200μl涂于PCNB平板， 23℃光照培养。从斜面培养基挑取少量菌丝，每份土样取2g放入100ml0.2%水琼脂中，稀释10倍，取土壤稀释液1ml涂抹于PCNB平板， 23℃光照培养，参照SDS病原菌特征，
挑取菌落转移至PDA营养培养基培养。
挑取目标菌落孢子，用无菌水稀释到孢子清晰个数，挑取单个孢子转移到PDA平板培养，用灭菌刀片挂去菌丝。真菌ITS区通用引物ITS1/4，在TIS2区SDS病原菌南北美种与菜豆种有少量稳定突变位点，用OMIGA对比，设计特异引物FVS/A。PCR反映体系： 25mmol/1MgCl2 2μl，10μmol/l引物各1μl，模板DNA4ng。反应条件经35个循环， 72℃延伸10min，EB染色15min。大豆猝死综合征病原菌在选择性培养基PCNB上生长缓慢，中心有黄色突
起，缺乏气生菌丝。PDA上菌落缺乏气生菌丝。在PDA上菌落与SDS病原菌络相似。对照标准菌株未发现与病原菌相似菌落，挑选菌落培养进行分子检测。
3. 结束语
本实验对大豆猝死综合症病原菌分子检测的改进，进行普通PCR可达到检测目的。相比其他研究，技术成本低，结果易于分析。Southern杂交是很好的研究植物病原种群结构工具，是复杂的DNA检测技术。等位基因特异性PCR对引物要求高，为避免反映中出现假阴性结果，加入阳性质控引物。大豆猝死综合征病原菌北美种广泛分布于阿根廷，传入中国可能性大，实验建立北美种检测鉴定方法。未来应研究SDS致病机制，建立南美种鉴定方法，用于实际检疫工作。作者简介：徐鑫（1983.4-），男，汉族，山东济宁人，研究生，中级农艺师，研究方向：农业环保。